鸡滑液囊支原体蛋白RpsF、RS01065、RS01880及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及鸡滑液囊支原体蛋白RpsF、RS01065、RS01880及其制备方法和应用；对三个蛋白进行大肠杆菌密码子优化，合成原核表达质粒，进行原核表达和蛋白纯化；使用纯化后的重组蛋白制备鼠源多抗，检测重组蛋白的免疫原性和抗原性；本发明专利技术的重组蛋白具有良好的免疫原性和抗原性，可以诱导SPF鸡产生高滴度的特异性抗体，能够显著减轻MS引起的临床症状和病理损伤；具有作为研制MS亚单位疫苗的潜力。有作为研制MS亚单位疫苗的潜力。有作为研制MS亚单位疫苗的潜力。

【技术实现步骤摘要】
鸡滑液囊支原体蛋白RpsF、RS01065、RS01880及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及鸡滑液囊支原体蛋白RpsF、RS01065、RS01880及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是一种对禽养殖业危害巨大的病原体，主要引起呼吸道疾病、滑膜炎以及蛋壳顶端异常综合征，与其他病原协同感染时会造成严重后果。MS传播能力极强，导致我国养殖场中MS阳性率很高。基于此情况，提高生物安全的同时使用疫苗进行预防接种是最为理想的防控手段。目前关于MS蛋白的研究还处于起步阶段，限制了基因工程亚单位疫苗的发展，研发MS的亚单位疫苗非常有价值和应用前景。
[0003]核糖体蛋白作为核糖体的主要成分，具有高度的保守型，在蛋白质生物合成中发挥重要作用，核糖体蛋白S6(RpsF)参与翻译、细胞大小、细胞增殖和葡萄糖稳态的调节。RS01065是一种血凝素蛋白，血凝素可以与宿主红细胞受体结合，导致凝血，作为一种毒力因子，具有免疫原性。RS01880与NCBI上的序列比对，结果为P37
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like ABC转运蛋白，这种蛋白普遍存在于所有生物中，可能是一种具有潜力的抗原。目前还没有关于鸡滑液囊支原体RpsF、RS01065和RS01880蛋白的报道，值得探索其作为疫苗候选抗原的潜力。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对上述现有技术存在的问题，提供鸡滑液囊支原体蛋白RpsF、RS01065、RS01880及其制备方法和应用；本专利技术对MS此前未被发现及研究过的蛋白RpsF、RS01065和RS01880进行了初步探索。对三个蛋白进行大肠杆菌密码子优化，合成原核表达质粒，进行原核表达和蛋白纯化；使用纯化后的重组蛋白制备鼠源多抗，检测重组蛋白的免疫原性和抗原性；进行动物实验，验证重组蛋白能否刺激SPF鸡产生免疫应答反应，并评价重组蛋白对感染MS的SPF鸡的保护效力。结果发现重组蛋白具有良好的免疫原性和抗原性，可以诱导SPF鸡产生高滴度的特异性抗体，能够显著减轻MS引起的临床症状和病理损伤。本专利技术所研究的MS蛋白RpsF、RS01065、RS01880，具有作为研制MS亚单位疫苗的潜力。
[0005]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0006]第一方面，本专利技术提供一种鸡滑液囊支原体蛋白的制备方法，所述方法如下：
[0007]步骤(1)：对鸡滑液囊支原体蛋白基因的密码子分别进行大肠杆菌偏好性优化，并将其TGA终止密码子替换为TGG；将优化后的基因合成到原核表达载体上，获得重组质粒；
[0008]步骤(2)：将步骤(1)获得的重组质粒转入工程菌中；获得蛋白的表达菌株；
[0009]步骤(3)：对步骤(2)中蛋白的表达菌株进行表达、纯化与鉴定得到蛋白。
[0010]优选的，所述鸡滑液囊支原体蛋白为RpsF；所述鸡滑液囊支原体蛋白优化后的RpsF基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其长度为468bp；所述鸡滑液囊支原体蛋白RpsF氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0011]步骤(1)对鸡滑液囊支原体蛋白RpsF基因的密码子进行大肠杆菌偏好性优化，并将其TGA终止密码子替换为TGG；将优化后的基因合成到原核表达载体pET28a，获得的重组质粒为pET28a
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RpsF；步骤(2)中所述工程菌为大肠杆菌BL21，获得蛋白的表达菌株BL21(pET28a
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RpsF)。
[0012]优选的，步骤(3)具体如下：将所得表达菌株BL21(pET28a
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RpsF)按1：100的比例接种于100mL含卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃，220rpm摇床，培养至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM/L的异丙基硫代半乳糖苷，继续在摇床上避光诱导表达4h，将表达后的菌液置于离心机，10000rpm/min离心6min收集菌体，用LE buffer洗涤2次后，用16mL LE buffer重悬，在低温条件下进行超声破碎，置于4℃离心机中，1000rpm/min离心15min，分别收集上清和沉淀备用，用8M尿素对包涵体进行处理，使用镍柱纯化包涵体，再通过透析复性包涵体。
[0013]优选的，所述鸡滑液囊支原体蛋白为RS01065；所述鸡滑液囊支原体蛋白优化后的RS01065基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其长度为1050bp；所述鸡滑液囊支原体蛋白RS01065氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
[0014]步骤(1)对鸡滑液囊支原体蛋白RS01065基因的密码子进行大肠杆菌偏好性优化，并将其TGA终止密码子替换为TGG；将优化后的基因合成到原核表达载体pET28a，获得重组质粒pET28a
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RS01065；步骤(2)中所述工程菌为大肠杆菌BL21，获得蛋白的表达菌株BL21(pET28a
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RS01065)。
[0015]优选的，步骤(3)具体步骤如下：将所得表达菌株BL21(pET28a
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RS01065)按1：100的比例接种于100mL含卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃，220rpm摇床，培养至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM/L的异丙基硫代半乳糖苷，继续在摇床上避光诱导表达4h，将表达后的菌液置于离心机，10000rpm/min离心6min收集菌体，用LE buffer洗涤2次后，用16mL LE buffer重悬，在低温条件下进行超声破碎，置于4℃离心机中，1000rpm/min离心15min，分别收集上清和沉淀备用，用8M尿素对包涵体进行处理，使用镍柱纯化包涵体，再通过透析复性包涵体。
[0016]优选的，所述鸡滑液囊支原体蛋白为RS01880；所述鸡滑液囊支原体蛋白优化后的RS01880基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其长度为1065bp；所述鸡滑液囊支原体蛋白RS01880氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
[0017]步骤(1)对鸡滑液囊支原体蛋白RS01880基因的密码子进行大肠杆菌偏好性优化，并将其TGA终止密码子替换为TGG；将优化后的基因合成到原核表达载体pET28a，获得重组质粒pET28a
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RS01880；步骤(2)中所述工程菌为大肠杆菌BL21，获得蛋白的表达菌株BL21(pET28a
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RS01880)。
[0018]优选的，步骤(3)具体步骤如下：将所得表达菌株BL21(pET28a
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RS01880)按1：100的比例接种于100mL含卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃，220rpm摇床，培养至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM/L的异丙基硫代半乳糖苷，继续在摇床上避光诱导表达4h，将表达后的菌液置于离心机，10000rpm/min本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸡滑液囊支原体蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法如下：步骤(1)：对鸡滑液囊支原体蛋白基因的密码子分别进行大肠杆菌偏好性优化，并将其TGA终止密码子替换为TGG；将优化后的基因合成到原核表达载体上，获得重组质粒；步骤(2)：将步骤(1)获得的重组质粒转入工程菌中；获得蛋白的表达菌株；步骤(3)：对步骤(2)中蛋白的表达菌株进行表达、纯化与鉴定得到蛋白。2.权利要求1所述的一种鸡滑液囊支原体蛋白的制备方法，其特征在于，所述鸡滑液囊支原体蛋白为RpsF；所述鸡滑液囊支原体蛋白优化后的RpsF基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其长度为468bp；所述鸡滑液囊支原体蛋白RpsF氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；步骤(1)对鸡滑液囊支原体蛋白RpsF基因的密码子进行大肠杆菌偏好性优化，并将其TGA终止密码子替换为TGG；将优化后的基因合成到原核表达载体pET28a，获得重组质粒pET28a
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RpsF；步骤(2)中所述工程菌为大肠杆菌BL21，获得蛋白的表达菌株BL21(pET28a
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RpsF)。3.根据权利要求2所述的一种鸡滑液囊支原体蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体如下：将所得表达菌株BL21(pET28a
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RpsF)按1：100的比例接种于100mL含卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃，220rpm摇床，培养至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM/L的异丙基硫代半乳糖苷，继续在摇床上避光诱导表达4h，将表达后的菌液置于离心机，10000rpm/min离心6min收集菌体，用LE buffer洗涤2次后，用16mL LE buffer重悬，在低温条件下进行超声破碎，置于4℃离心机中，1000rpm/min离心15min，分别收集上清和沉淀备用，用8M尿素对包涵体进行处理，使用镍柱纯化包涵体，再通过透析复性包涵体。4.根据权利要求1所述的一种鸡滑液囊支原体蛋白的制备方法，其特征在于，所述鸡滑液囊支原体蛋白为RS01065；所述鸡滑液囊支原体蛋白优化后的RS01065基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其长度为1050bp；所述鸡滑液囊支原体蛋白RS01065氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；步骤(1)对鸡滑液囊支原体蛋白RS01065基因的密码子进行大肠杆菌偏好性优化，并将其TGA终止密码子替换为TGG；将优化后的基因合成到原核表达载体pET28a，获得重组质粒pET28a
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RS01065；步骤(2)中所述工程菌为大肠杆菌BL21，获得蛋白的表达菌株BL21(pET28a
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RS01065)。5.根据权利要求4所述的一种鸡滑液囊支原体蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体步骤如下：将所得表达菌株BL21(pET28a
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RS01065)按1：1...

【专利技术属性】
技术研发人员：石火英，韩乐嘉宝，张桂华，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：