猪RIG-I样受体MDA5特异性单克隆抗体和应用制造技术

本发明专利技术公开了猪RIG

【技术实现步骤摘要】
猪RIG
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I样受体MDA5特异性单克隆抗体和应用
[0001]本专利技术专利申请是分案申请，原案的申请号为202210680936.8，申请日为2022
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06
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15，专利技术名称为猪RIG
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I样受体特异性单克隆抗体及其制备方法和应用。


[0002]本专利技术属于医学和生物学
，具体涉及猪RIG
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I样受体MDA5特异性单克隆抗体和应用。

技术介绍

[0003]据了解，单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要技术，其在蛋白质的结构与功能研究方面、在人类和动植物的免疫学诊断方面都发挥着无可代替的重要作用。单克隆抗体在疾病预防、临床治疗、疾病诊断及检测中均有众多应用，同时单克隆抗体在生物学研究领域作为研究工具也得到广泛使用。天然免疫是机体防御感染的第一道防线，天然免疫通过一系列模式识别受体(PRR)家族识别来自病原体的各种保守分子从而启动细胞信号和免疫应答。天然免疫RIG
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I样受体(RLR)家族是胞浆内的双链RNA(dsRNA)识别受体，在识别和防御病毒尤其是RNA病毒感染中发挥关键作用。RLR家族包括RIG
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I、MDA5和LGP2三个成员。
[0004]RIG
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I是最早发现的RLR原型受体，包括N端的两个半胱天冬酶活化募集结构域(CARDs)；中间的RNA解旋酶结构域，能够和C端结构域一起结合RNA；C端的编码自身活化抑制域(RD)或被称为调节结构域(RD)，负责识别并结合病毒RNA。没有病毒感染时，RIG
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I呈静息状态，活性区CARDs与CTD和RNA解旋酶结构域结合，后者阻止CARDs与修饰蛋白接触活化。RIG
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I能够识别5'
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三磷酸dsRNA(5'
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ppp
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dsRNA)和短链dsRNA(＜300bp)。RIG
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I在抗病毒免疫中发挥重要作用，这些病毒包括大多数单负链RNA病毒，如副粘病毒家族的新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、正粘病毒科的流感病毒、弹状病毒科的水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)和狂犬病病毒(Rabies virus，RV)，单正链RNA病毒如日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，以及一些DNA病毒如腺病毒和痘苗病毒等。
[0005]MDA5与RIG
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I具有相似的分子结构，包括N端的两个半胱天冬酶活化募集结构域(CARDs)；中间的RNA解旋酶结构域，能够和C端结构域一起结合RNA；C端的编码自身活化抑制域(RD)或被称为调节结构域(RD)，负责识别并结合病毒RNA。没有病毒感染时，MDA5呈静息状态，活性区CARDs与CTD和RNA解旋酶结构域结合，后者阻止CARDs发生活化。MDA5优先识别长的双链RNA(dsRNA)(＞1000bp)。MDA5同样在抗病毒免疫中发挥重要作用，这些病毒主要为小核糖核酸病毒科的病毒如脑心肌炎病毒(EMCV)，还有呼肠孤病毒科病毒如轮状病毒(Rotavirus)等。
[0006]LGP2缺少N端的信号活性区域(CARDs)，但其能够与配体dsRNA高亲和力结合，发挥重要的调控功能。在RIG
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I和MDA5信号介导的抗病毒免疫中，LGP2发挥的确切调控功能和作用机制尚未明晰，另外LGP2在细胞免疫应答中的作用及机制研究更需要进一步深入。
[0007]猪是非常重要的经济动物，但由于缺乏商业化的猪RLR蛋白RIG
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I、MDA5和LGP2抗体工具，也没有猪RLR单克隆抗体的文献报道(现有RLR蛋白抗体都是人和鼠RLR的抗体，与猪RLR蛋白的交叉反应性没有测试数据，并不能与猪RLR蛋白进行反应)，猪RLR蛋白功能相关研究非常缺乏。此外，猪还是包括传染病在内的多种人类疾病非常有前途的动物模型，因此研制出能区分猪和人RLR的特异抗体来研究其种属差异显得非常必要。

技术实现思路

[0008]本专利技术针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种猪RIG
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I样受体MDA5特异性单克隆抗体和应用。
[0009]本专利技术鉴于RLR包括猪RLR在抗病毒中的关键作用，为了弥补猪RLR商业化抗体的空白，使用细胞融合杂交瘤技术制备猪RLR所有三种蛋白的特异性单克隆抗体，将获得的猪RLR单克隆抗体成功用于各种免疫学试验，并可以用于猪和人RLR的比较免疫学研究。
[0010]本专利技术提供了猪RIG
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I样受体特异性单克隆抗体，所述猪RIG
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I样受体特异性单克隆抗体为猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体，所述猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体由杂交瘤细胞株pMDA5 mAb产生，所述杂交瘤细胞株pMDA5 mAb的保藏编号为CCTCC NO:C2022134，。
[0011]本专利技术提供了猪RLR家族三种蛋白的特异性单克隆抗体，与人RLR无交叉反应，只与猪RLR发生反应。本专利技术针对猪RIG
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I样受体(RLR)家族成员RIG
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I、MDA5和LGP2的特异单克隆抗体为猪RLR研究提供特定有用工具。已经成功地应用于各种免疫学试验，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹(WB)、免疫荧光(IFA)和免疫组织化学(IHC)实验，可以应用于猪RLR蛋白的检测和RLR蛋白抗病毒功能研究。此外，猪特异性RLR蛋白单克隆抗体还可以用于猪和人RLR的种属特异性比较免疫学研究。
[0012]本专利技术进一步的技术方案如下：
[0013]优选地，所述猪RIG
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I蛋白特异性单克隆抗体能够识别RIG
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I蛋白的C端Δ2CARDs片段(201
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943aa)，所述猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体能够识别MDA5蛋白的C端Δ2CARDs片段(201
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1023aa)，所述猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体能够识别LGP2蛋白的N端L1(1
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200aa)片段。
[0014]优选地，所述猪RIG
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I蛋白特异性单克隆抗体、猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体、猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体均为IgG2b的同型免疫球蛋白。
[0015]本专利技术还提供一种猪RIG
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I样受体特异性单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0016]步骤1、从猪肺泡巨噬细胞中提取总RNA，经反转录扩增得到猪RIG
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I、猪MDA5、猪LGP2的编码基因，猪RIG
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I、猪MDA5、猪LGP2的编码基因分别经过原核表达、纯化后获得猪pRIG
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I蛋白、猪pMDA5蛋白、猪LGP2蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 猪RIG
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I样受体MDA5特异性单克隆抗体，其特征在于：所述猪RIG
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I样受体MDA5特异性单克隆抗体为猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体，所述猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体由杂交瘤细胞株pMDA5 mAb产生，所述杂交瘤细胞株pMDA5 mAb的保藏编号为CCTCC NO:C2...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱建中，邵琦，李双洁，曹琦，张佳佳，张友文，孙少华，张凯莉，郑王龙，陈南华，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：