本发明专利技术属于微生物及发酵工程技术领域，具体涉及一种利用木质纤维素水解液生产丁二酸的高耐受酵母工程菌株及其应用。本发明专利技术是在酵母细胞中将谷胱甘肽合成酶超表达，有助于提高其糠醛耐受能力。经试验证明，所述菌株能够利用含有糠醛等抑制物的木质纤维素水解液。经发酵培养后，丁二酸产量达到37.4g/L，转化率达到0.78g/g葡萄糖/木糖。同时上述工程菌在培养过程中可以进行低pH发酵，从而减少工业生产过程中对培养液pH进行调节的步骤，进一步节约成本，从而表明其在在食品、化工及可降解材料等诸多领域具有良好的实际应用价值和前景。诸多领域具有良好的实际应用价值和前景。诸多领域具有良好的实际应用价值和前景。
【技术实现步骤摘要】
一种利用木质纤维素水解液生产丁二酸的高耐受酵母工程菌株及其应用
[0001]本专利技术属于微生物及发酵工程
，具体涉及一种利用木质纤维素水解液生产丁二酸的高耐受酵母工程菌株及其应用。
技术介绍
[0002]本专利技术
技术介绍
中公开的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]石油、天然气与煤炭等传统石化资源的使用伴随着CO2的排放，进而加剧温室效应，当前的背景是石化资源耗竭，但是人类对石化资源的需求仍在增加。木质纤维素生物质是太阳能储存在绿色植物中丰富的可再生资源，年产量大，种类多。一般组成成分为纤维素，半纤维素和木质素。纤维素降解为葡萄糖，半纤维素降解为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等，衍生产品多，广泛应用于食品、生物能源、塑料等行业。因此开发非粮基生物质资源生产各种化学品有利于缓解资源危机。
[0004]然而，木质纤维素预处理后的降解产物影响着微生物的高价值转化。对于木质纤维素的降解目前较为普遍是采用稀酸解，降解产物除了葡萄糖、木糖等丰富的碳源外，还有甲酸、乙酸、糠醛与羟甲基糠醛等抑制物。糠醛与羟甲基糠醛(Hydroxymethyl furfural,HMF)是预处理过程中酸性条件下分别由木糖，阿拉伯糖等戊糖和葡萄糖，甘露糖等己糖脱水形成。糠醛是对微生物有强烈抑制作用的副产物，引起氧化损伤，主要抑制糖代谢过程中一些酶(如己糖激酶等)的活性。甲酸与乙酸是木质纤维素水解液预处理后最常见的有机酸类抑制物。通常预处理后的水解液呈弱酸性坏境，引起细胞内酸化。为维持细胞内环境稳态，菌体内将耗费大量ATP泵出多余的H
+
，使得其他耗能代谢过程受到干扰，细胞稳定性被破坏，导致细胞死亡，最终影响微生物发酵。
[0005]丁二酸(Succinic acid，又称琥珀酸)是一种重要的C4二羧酸，广泛应用于清洁剂、表面活性剂、食品添加剂、抗菌剂以及制药行业，被美国能源部选为十二种最具商业价值的平台化合物之首。丁二酸也是生产聚丁二酸丁二醇酯PBS、聚丁二酸己二酸丁二醇酯PBSA等生物可降解塑料的重要原料，最近随着国家限塑令的严格执行可降解塑料的市场需求不断增加，现有的丁二酸产能已无法满足市场供给。丁二酸的合成主要采用化学工艺路线，但是相比生物发酵法而言化学法生产丁二酸存在能耗高、污染严重、温室气体排放等缺点。因此，开发绿色、可持续的丁二酸高效发酵技术具有重要的实际意义。进一步的，木质纤维素生物质属于低价碳源，具有不与人畜争粮，不与粮争地的优势。然而，专利技术人发现，目前鲜少有关于酵母发酵木质纤维素生产丁二酸的报道。
技术实现思路
[0006]针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种利用木质纤维素水解液
生产丁二酸的高耐受酵母工程菌株及其应用。本专利技术以专利技术人前期构建的高产丁二酸解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)作为出发菌，研究不同浓度玉米芯水解液对细胞生长和丁二酸合成的影响，证实了该菌株在利用木质纤维素水解液合成丁二酸方面的潜力。测定酵母工程菌株对不同单一抑制物的耐受浓度范围，并通过过表达一系列抑制物耐受相关基因提高其耐受性。最终获得一株谷胱甘肽合成酶过表达菌株，能够显著提高酵母菌株对糠醛耐受能力，有望应用于以廉价的木质纤维素水解液为底物的丁二酸工业化生产中。基于上述研究成果，从而完成本专利技术。
[0007]为了实现上述技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0008]本专利技术的第一个方面，提供一种利用木质纤维素水解液生产丁二酸的高耐受酵母工程菌株，所述高耐受酵母工程菌株其是在出发菌株基础上过表达谷胱甘肽合成酶。本专利技术通过试验证明，通过过表达谷胱甘肽合成酶，上述高耐受酵母工程菌株显著提高糠醛耐受性，能够利用含有葡萄糖或者木糖的木质纤维素水解液培养基高效生产丁二酸。
[0009]本专利技术的第二个方面，提供上述高耐受酵母工程菌株的构建方法，所述构建方法包括：
[0010]以具有线粒体定位还原TCA途径的高产琥珀酸酵母工程菌株作为出发菌株，过表达谷胱甘肽合成酶。
[0011]本专利技术的第三个方面，提供上述高耐受酵母工程菌株在利用木质纤维素生产丁二酸中的应用。
[0012]本专利技术的第四个方面，提供一种丁二酸的工业化生产方法，所述工业化生产方法包括：对上述高耐受酵母工程菌株进行木质纤维素为碳源的发酵培养，并分离获取所述丁二酸。
[0013]本专利技术的第五个方面，提供上述高耐受酵母工程菌株和/或上述工业化生产方法在如下任意一种或多种中的应用：
[0014](a)化工；
[0015](b)可降解材料；
[0016](c)食品；
[0017](d)医药。
[0018]上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
[0019]上述技术方案公开了一种新的解脂耶氏酵母工程菌株，可耐受较高浓度木质纤维素水解液，其作为丁二酸生产菌能够带来理想的产量和转化率；所述菌株能够利用廉价的碳源和氮源，经发酵培养后，丁二酸产量最高达到37.4g/L，转化率达到0.78g/g葡萄糖/木糖。同时研究证明，上述工程菌在培养过程中可以进行低pH发酵，该特点有效的减少工业生产过程中对培养液pH进行调节的步骤，进一步节约成本。
[0020]上述技术方案在构建工程菌株SA4
‑
Gsh2时采用新的技术方法，即谷胱甘肽合成酶在丁二酸生产中的应用，显著提高了木质纤维素水解液耐受性和丁二酸产量，因此上述工程菌具有良好的实际应用价值和前景。
附图说明
[0021]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示
意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0022]图1为本专利技术实施例2中不同初始玉米芯水解液浓度对丁二酸合成影响的结果图；其中，A中初始葡萄糖浓度为20g/L；B中初始葡萄糖浓度为30g/L；C中初始葡萄糖浓度为40g/L；D中初始葡萄糖浓度为50g/L。
[0023]图2为本专利技术实施例3中解脂耶氏酵母丁二酸高产菌株对不同单一抑制物的耐受浓度范围。
[0024]其中，A为甲酸；B为乙酸；C为HMF；D为糠醛。
[0025]图3为本专利技术实施例4中酵母工程菌株的糠醛耐受相关基因改造及其功能验证。
[0026]其中，A为0.4g/L糠醛对不同菌株生长的影响；B为添加0.4g/L糠醛条件下不同菌株发酵性能对比。
[0027]图4为本专利技术实施例4中Gsh2过表达前后胞内GSH含量变化。
[0028]其中，A为添加或者不添加糠醛时各个菌株还原型谷胱甘肽含量检测；B为SA4
‑
Gsh2菌株糠醛解毒机制示意图。
[0029]图5为本专利技术实施例4中糠醛耐受性提高工程菌株SA4
‑
Gsh2的玉米芯水解液发酵验证。
[0030]其中，A为葡萄糖消耗；B为木糖消耗；C为丁二酸合成；本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种利用木质纤维素水解液生产丁二酸的高耐受酵母工程菌株，其特征在于，所述高耐受酵母工程菌株其是在出发菌株基础上过表达谷胱甘肽合成酶；其中，所述出发菌株为具有线粒体定位还原TCA途径的高产琥珀酸酵母工程菌株。2.如权利要求1所述的高耐受酵母工程菌株，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶，其来源包括Yarrowia lipolytica、Saccharomyces cerevisiae、Arabidopsis thaliana，进一步为Yarrowia lipolytica；更进一步的，编码所述谷胱甘肽合成酶的基因序列(YALI0C17831p)如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1所述的高耐受酵母工程菌株，其特征在于，所述高耐受酵母工程菌株为解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)SA4
‑
Gsh2，其基因型为MatA,xpr2
‑
322,axp
‑
2,leu2
‑
270,ura3
‑
302,ΔSdh5::loxP,ΔAch1::loxP,YlPyc,TbFrd,EcFum,YlMdh1,Pgl
G75S
,mTbFrd,YlMdh2,SpMae1,YlGsh2；其是将YlGsh2(SEQ ID NO.1)基因导入解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)Mbmr
‑
SA4(其基因型为其基因型为MatA,xpr2
‑
322,axp
‑
2,leu2
‑
270,ura3
‑
302,ΔSdh5::loxP,ΔAch1::loxP,YlPyc,TbFrd,EcFum,YlMdh1,Pgl
G75S
,mTbFrd,YlMdh2,SpMae1，具体见CN114806913A)后获得。4.权利要求1
‑
3任一项所述高耐受酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：以具有线粒体定位还...
【专利技术属性】
技术研发人员：祁庆生，卢雪梅，崔志勇，谷金红，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。