一种递送内皮细胞膜纳米颗粒的温敏水凝胶及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种递送内皮细胞膜纳米颗粒的温敏水凝胶及制备方法，包括内皮细胞膜、内皮细胞膜包载药物纳米颗粒和温敏性壳聚糖

【技术实现步骤摘要】
一种递送内皮细胞膜纳米颗粒的温敏水凝胶及制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医药技术，具体涉及一种递送内皮细胞膜纳米颗粒的温敏水凝胶及制备方法。

技术介绍

[0002]炎症反应是多种眼表疾病，如干眼症、睑板腺功能障碍、角膜碱烧伤、睑缘炎等的共性表现。以干眼为例，干眼是因泪液质/量的异常以及泪液动力学异常引起的眼部不适、眼表损害的疾病总称，常伴有不同程度的炎症反应，是最常见的眼表疾病之一。临床主要表现为干涩、烧灼、异物感、视物模糊及视疲劳等。重症干眼还可以因为持续、级联放大的炎症反应引起角膜炎、角膜新生血管，甚至角膜溃疡，严重影响患者视功能与生活质量。目前研究认为，抗炎治疗是治疗上述疾病，平衡眼表稳态的重要方向。
[0003]糖皮质激素滴眼液是临床常用的抗炎药物，可以有效抑制眼表炎症因子的表达。但是，长期使用糖皮质激素可以引起严重的眼部副作用，如白内障、青光眼。尤其在角膜碱烧伤患者病程中期使用糖皮质激素会引起角膜溶解甚至穿孔的发生。近年研究发现，多种非糖皮质激素类药物，如多西环素、阿奇霉素、环孢素、雷帕霉素、吲哚美辛等可以通过抑制人角膜上皮及结膜上皮炎性因子的表达，缓解眼表炎症微环境，并降低角膜碱烧伤后角膜溶解与穿孔的发生率。
[0004]滴眼液是治疗眼表炎症性疾病的重要给药方式，但是存在药物靶向性不佳，生物利用度低，用药频次高导致患者依从性差等问题。细胞膜纳米颗粒可以有效提高药物对炎症微环境的靶向性。细胞膜包被仿生纳米药物兼具了细胞膜表面所具有的物质成分以及多功能内核纳米载体的结构和功能，不但能实现生物学的仿生功能，如内源“隐身”、躲避免疫清除、避免特异识别等，还展现出良好的生物相容性。因此，细胞膜包被作为一种简单的自上而下的创新技术，其以细胞膜为载体，可运载功能性多变的多种药物，即可实现仿生纳米药物主动靶向病灶药物递送及定点药物控释。目前，红细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、免疫细胞、血小板、上皮细胞等来源的细胞膜组分已取得深入研究，并取得了良好的抗炎效果。在炎症反应时，炎症细胞可以通过与血管内皮细胞间通过多种配体
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受体结合，向炎症病灶积聚。因此，内皮细胞来源的细胞膜载药纳米颗粒可以靶向病灶的炎症细胞，增加药物的靶向性。
[0005]水凝胶体系可以实现纳米药物控释，提升患者依从性。水凝胶是一种具有三维网络结构的亲水性凝胶。温敏水凝胶作为一种智能高分子水凝胶，能够响应环境中微小的温度变化，是智能水凝胶中研究最为广泛的。由于眼表结构的特殊性，温敏水凝胶具有使用简便、舒适度高、安全性等优点。
[0006]基于上述原因，递送内皮细胞膜纳米颗粒的温敏水凝胶可以增加药物的稳定性与炎症微环境靶向性，实现药物的缓释与长效作用，减少用药次数，降低药物在眼表的浓度波动，提高药物的生物利用度。降低药物的毒副作用，提高患者的依从性。

技术实现思路

[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种递送内皮细胞膜纳米颗粒的温敏水凝胶及制备方法，包括内皮细胞膜、内皮细胞膜包载药物纳米颗粒和温敏性壳聚糖
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甘油磷酸钠温敏性水凝胶，所述内皮细胞膜选自人脐静脉内皮细胞膜、人脑微血管内皮细胞、人肺微血管内皮细胞中的一种，所述内皮细胞膜包载药物纳米颗粒按水溶性分为亲水性与疏水性，其中亲水性药物可选自盐酸多西环素、胆绿素、阿奇霉素、地塞米松磷酸钠和溴芬酸钠中的一种或多种。疏水性药物可选自胆红素、环孢素、雷帕霉素、萝卜硫素、白芦藜醇、醋酸泼尼松龙、氢化可的松、氯替泼诺、1
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(4
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氯苯甲酰基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
甲基
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1H
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吲哚
‑3‑
乙酸（吲哚美辛）、2
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(4
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异丁基苯基)丙酸和2
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[(2,6
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二氯苯基)氨基]苯乙酸钠（双氯芬酸钠）中的一种或多种，所述温敏性壳聚糖
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甘油磷酸钠温敏性水凝胶主要包括天然聚合物聚多糖（纤维素、壳聚糖和木葡聚糖）和蛋白质（明胶）的温度敏感性水凝胶体系。此外，还有一些合成高分子水凝胶主要包括聚丙烯酰胺类、聚醚类、聚氨基酸类、聚酯类水凝胶。
[0008]S1
‑
1：内皮细胞膜的提取步骤如下：称取,Hepes：1.19g，MgCl2：0.238g，EDTA：0.146g，DTT：0.077g，KCl：0.373g，充分搅拌混匀，得到PH为7.6的Hepes缓冲液B；称取，Hepes：5.957g，NaCl：2.922g，KCl：6.746g，充分搅拌混匀，得到PH为7.6的Hepes缓冲液C；S1
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2膜碎片的提取步骤如下:将细胞上清弃掉，加入新鲜培养基重悬内皮细胞，收集内皮细胞300g进行离心处理3min，然后将培养液弃掉，加入配制好的HepesB缓冲液2mL，使用IKA T18 basic均质机对细胞进行破碎。此后，将细胞碎片进行破碎，转速为1000r/min，进行3min，收集上清，将沉淀重悬。
[0009]S1
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3：蔗糖密度梯度离心提取膜碎片的步骤如下:使用HepesB配制蔗糖质量分数分别为55%、40%、30%的溶液，并按照从下向上的顺序依次加入到超高速离心机专用离心管中，在温度为4℃下进行过夜静置。将含有膜碎片的HepesB加入铺有蔗糖的离心管中，使用超高速离心机进行离心,在4℃条件下，离心1h,离心转速设定为14000g，离心结束后，收集不同蔗糖浓度条件下的条带，此后将其加入装有HepesC的缓冲液中，再次使用超高速离心进行脱糖,在4℃条件下，离心15min,离心转速设定为14000g，离心结束后,收集沉淀，用1mLHepesC对沉淀进行重悬，经过多次超速离心后，即可得到内皮细胞膜碎片。
[0010]其中，所述内皮细胞膜纳米颗粒的制备步骤如下：S2
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1：取一定量已提取成功的内皮细胞膜碎片并溶于缓冲液Hepes C中，依次经过800nm、400nm、200nm的滤膜通过脂质体挤压器进行挤压，挤压成功后，即可得到内皮细胞膜纳米颗粒。使用Malvern ZEN 3600 Zetasizer仪器进行尺寸和表面Zeta电位测量。通过流式细胞术测量在内皮细胞膜纳米颗粒的特征性蛋白ICAM
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1等。
[0011]S2
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2：使用分析天平称取盐酸多西环素，使用磷酸盐缓冲液溶解，配制盐酸多西环素溶液，并将配制好的盐酸多西环素溶液稀释为不同浓度梯度，将100ug的内皮细胞膜纳米颗粒与不同浓度梯度的盐酸多西环素溶液进行混合，将其置于电转槽内，使用电转仪孵育后，可将盐酸多西环素装载至仿生纳米颗粒中，即可得到盐酸多西环素负载的仿生纳米颗
粒。通过HPLC（Shimadzu）计算盐酸多西环素在仿生纳米颗粒中的装载效率。
[0012]其中，温敏性壳聚糖
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甘油磷酸钠温敏性水凝胶的制备及仿生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种递送内皮细胞膜纳米颗粒的温敏水凝胶及制备方法，其特征在于：包括内皮细胞膜、内皮细胞膜包载药物纳米颗粒和温敏性壳聚糖
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甘油磷酸钠温敏性水凝胶，所述内皮细胞膜选自人脐静脉内皮细胞膜、人脑微血管内皮细胞、人肺微血管内皮细胞中的一种，所述内皮细胞膜包载药物纳米颗粒按水溶性分为亲水性与疏水性，其中亲水性药物可选自盐酸多西环素、胆绿素、阿奇霉素、地塞米松磷酸钠和溴芬酸钠中的一种或多种。疏水性药物可选自胆红素、环孢素、雷帕霉素、萝卜硫素、白芦藜醇、醋酸泼尼松龙、氢化可的松、氯替泼诺、1
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氯苯甲酰基)
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甲氧基
‑2‑
甲基
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1H
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吲哚
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乙酸（吲哚美辛）、2
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异丁基苯基)丙酸和2
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二氯苯基)氨基]苯乙酸钠（双氯芬酸钠）中的一种或多种，所述温敏性壳聚糖
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甘油磷酸钠温敏性水凝胶主要包括天然聚合物聚多糖（纤维素、壳聚糖和木葡聚糖）和蛋白质（明胶）的温度敏感性水凝胶体系。此外，还有一些合成高分子水凝胶主要包括聚丙烯酰胺类、聚醚类、聚氨基酸类、聚酯类水凝胶。2.根据权利要求1所述的一种递送内皮细胞膜纳米颗粒的温敏水凝胶及制备方法，其特征在于：内皮细胞膜的提取步骤如下：S1
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1：称取,Hepes：1.19g，MgCl2：0.238g，EDTA：0.146g，DTT：0.077g，KCl：0.373g，充分搅拌混匀，得到PH为7.6的Hepes缓冲液B；称取，Hepes：5.957g，NaCl：2.922g，KCl：6.746g，充分搅拌混匀，得到PH为7.6的Hepes缓冲液C；S1
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2膜碎片的提取步骤如下:将细胞上清弃掉，加入新鲜培养基重悬内皮细胞，收集内皮细胞300g进行离心处理3min，然后将培养液弃掉，加入配制好的HepesB缓冲液2mL，使用IKA T18 basic均质机对细胞进行破碎。此后，将细胞碎片进行破碎，转速为1000r/min，进行3min，收集上清，将沉淀重悬。S1
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3：蔗糖密度梯度离心提取膜碎片的步骤如下:使用HepesB配制蔗糖质量分数分别为55%、40%、30%的溶液，并按照从下向上的顺序依次加入到超高速离心机专用离心管中，在温度为4℃下进行过夜静置。将含有膜碎片的HepesB加入铺有蔗糖的离心管中，使用超高速离心机进行离心,在4℃条件下，离心1h,离心转速设定为14000g，离心结束后，收集不同蔗糖浓度条件下的条带，此后将其加入装有HepesC的缓冲液中，再次使用超高速离心进行脱糖,在4℃条件下，离心15min,离心转速设定为14000g，离心结束后,收集沉淀，用1mLHepesC对沉淀进行重悬，经过多次超速离心后，即可得到内皮细胞膜碎片。3.根据权利要求1所述的一种递送内皮细胞膜纳米颗粒的温敏水凝胶及制备方法，其特征在于：内皮细胞膜纳米颗粒的制备步骤如下：S2
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【专利技术属性】
技术研发人员：武广昊，黄扬，苏丽，俞思伟，
申请(专利权)人：黄扬，
类型：发明
国别省市：