一种含附属器的组织工程皮肤的制备方法技术

一种含附属器的组织工程皮肤的制备方法，本发明专利技术是在凝胶溶液中接种羊膜间充质干细胞、向毛乳头方向诱导的羊膜间充质干细胞、羊膜上皮细胞、向汗腺上皮方向诱导的羊膜上皮细胞，经真皮层培养后，再经形成毛囊、汗腺结构的诱导培养，于其表面再接种羊膜上皮细胞和经向角质形成细胞诱导的羊膜上皮细胞，培养后得到具有毛囊、汗腺结构的组织工程皮肤，该皮肤不仅具有弹性、韧性，细胞新陈代谢旺盛、增殖能力强，细胞外基质分泌充分，表皮层与基膜和真皮层细胞连接紧密、不易脱落，提高了移植的成功率，能促进创面的愈合、提高修复和替代的效果，具有调节受体免疫排斥的作用；所含的毛囊、汗腺结构，使皮肤功能更完全；采用的羊膜组织为分娩后废弃物、来源广泛，细胞增殖能力强、传代次数多，有利于种子细胞的规模生产，降低产业化成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医用生物材料的组织工程
，具体涉及采用羊膜来源细胞构建具有附属器组织工程皮肤的方法。
技术介绍
皮肤是人体最大的器官，具有保护机体、调节体温、排泄废物的功能，是覆盖与保 护体表和内脏器官的重要组织。炎症、溃疡、外伤、烧伤、肿瘤术后以及先天畸形等原因常造 成皮肤和粘膜的缺损及异常。正常的皮肤含有分化良好的表皮层和真皮层，理想的愈合创 面应具有完整的表皮层、真皮层以及毛囊、汗腺等附属器结构；表皮层能够起到屏障和保护 作用，防止有害物质通过体表进入机体；真皮层为皮肤提供机械保护和外观特征，在创面愈 合、生长、抵抗细菌及防御外伤方面发挥着重要作用；毛囊、汗腺等附属器结构主要参与皮 肤新陈代谢及温度调节。 大量的实验和临床证明，组织工程方法制备的皮肤替代物能够用于创面修复重 建，国内外已有成熟的组织工程全层皮肤产品上市销售。但目前的皮肤产品不具有毛囊和 汗腺等附属器，毛囊可帮助皮肤排热及参与皮肤新陈代谢，汗腺具有分泌汗液、调节体温的 作用。各种原因造成的皮肤损伤，在伤及真皮深层，使汗腺不能再生，导致汗液排泄障碍，严 重影响患者生活质量。 另外，现有商品化的组织工程皮肤是使用成体细胞进行创面治疗，这不但影响治 疗效果，还存在因受体免疫排斥导致治疗失败的风险；而且，来自成体组织的成纤维细胞、 间充质干细胞、表皮细胞的增殖速度和代谢缓慢，细胞分泌蛋白的能力弱。由于表皮层与真 皮层能否建立紧密的连接，取决于表皮细胞能否合成充足的半桥粒，以及表皮细胞与间充 质干细胞能否合成分泌大量的细胞外基质；这是因为表皮层与表皮层下基膜的紧密连接需 要表皮细胞能够合成大量的半桥粒参与，而基膜则是由真皮层中成纤维细胞或间充质干细 胞与表皮层的表皮细胞共同分泌的细胞外基质形成。现有组织工程皮肤的表皮层脱落正是 由于表皮层与真皮层缺乏有效连接所造成。 因表皮细胞在体外培养过程中，有失去角质化特征的趋势，致使所制备的组织工 程皮肤的表皮层脆性增大，不能正常发挥表皮层的功能，这也是多年困扰组织工程皮肤领 域的技术难题。 由于间充质干细胞具有较强的增殖及多向分化能力，现已广泛应用于组织工程皮 肤的构建。间充质干细胞作为种子细胞，接种于组织工程皮肤用于人体治疗，所以间充质干 细胞的生命活力直接决定着组织工程皮肤的治疗效果。本申请人研究证实，间充质干细胞 的生命活力与来源组织的年龄有着密切关系，来源于胚胎组织的间充质干细胞比来自于成 年组织的同类细胞有更强的生命活力，同时，胚胎组织来源的间充质干细胞的免疫原性远 远低于成年组织的；最近的研究发现，间充质干细胞能够调节受体的免疫排斥，降低应用于 受体后免疫排斥的风险。所以，胚胎来源的间充质干细胞比成体组织来源的间充质干细胞 具有更加广阔的应用前景。 由于这些显著的优势，来源于人体胚胎时期，且无伦理争议的羊膜间充质干细胞 和羊膜上皮细胞被人们寄予了厚望，成为当前研究的热点。通过研究发现，羊膜间充质干细 胞的细胞状态介于成体干细胞与胚胎干细胞之间，属于"年轻的"成体干细胞，一般传至30 代仍能保持旺盛的代谢功能，羊膜来源的这两种细胞都被证明具有多向诱导分化能力。并 且羊膜间充质干细胞移植入体内后能够调节受体的免疫排斥，提高皮肤移植的成功率。同 时，研究还证实羊膜上皮细胞具有促进表皮类细胞角质化分化状态的作用。这些特点使得 羊膜来源细胞作为组织工程的种子细胞应用成为可能。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，所制备的组织工程皮肤含有毛囊、汗腺的附属器结构，在用于修复皮肤或软组织损伤形成的创面，能够减少瘢痕形成、在创面生成毛囊及汗腺结构、恢复创面的外观及散热功能、调节受体免疫排斥，且使表皮层与真皮层连接紧密，表皮层不易脱落，完成受损皮肤的全层修复。 本专利技术含附属器的组织工程皮肤的制备方法，包括有细胞的获得、扩大培养、定向诱导分化，以及组织工程双层皮肤的制备，其特征在于是在凝胶溶液中接种羊膜间充质干细胞、向毛乳头方向诱导的羊膜间充质干细胞、羊膜上皮细胞、向汗腺上皮方向诱导的羊膜上皮细胞，经真皮层培养后，再经形成毛囊、汗腺结构的诱导培养，于其表面再接种羊膜上皮细胞和经向角质形成细胞诱导的羊膜上皮细胞，经组织工程双层皮肤的培养得到含有毛囊、汗腺结构的组织工程皮肤；其中的毛囊结构由向毛乳头方向诱导后的羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞共同构建，汗腺结构由向汗腺上皮方向诱导后的羊膜上皮细胞构建；以羊膜上皮细胞和向角质形成细胞方向诱导后的羊膜上皮细胞构建表皮层，以具有诱导形成毛囊、汗腺结构作用的凝胶溶液与羊膜间充质干细胞构建真皮层；所述的凝胶溶液含有细胞外基质和有诱导形成毛囊、汗腺结构作用的蛋白。 本专利技术含附属器的组织工程皮肤制备方法的具体步骤包括 步骤一.材料、培养液及细胞的准备 制备细胞外基质取新鲜动物胚胎皮肤剪碎绞成肉泥，加入4倍体积的3% (V/V) 乙酸溶液在4t:条件下搅拌12小时，该乙酸溶液含有lg/L浓度的胃蛋白酶；离心取上清， 加入NaCl至终浓度为0. 9M盐析沉淀，离心取沉淀，将沉淀物溶解于0. 1M的Tris-HCl溶液 (pH7. 2)，向其中加入NaCl至终浓度为1. 7M盐析沉淀，离心取上清，再加入NaCl至终浓度 为2. 6M盐析沉淀，离心弃上清，沉淀物用V/V为1%的乙酸溶液溶解后，用超纯水透析纯化； 经真空冻干后消毒，获得细胞外基质； 制备具有诱导形成毛囊、汗腺结构作用的凝胶溶液无菌条件下，将制备的细胞外 基质溶于V/V为0. 1%的乙酸溶液中，浓度为5 12mg/ml (4"C储存可防止细胞外基质降 解)；将该溶液在冰浴下紫外线照射，操作过程确保处于冷却状态；按该溶液的体积比分别 加入10%的胎牛血清和10%的DMEM培养基，再加入wnt3a蛋白300 500ng/ml和硫酸肝 素糖蛋白100 300ng/ml，调pH至7. 2，得到凝胶溶液; 配制培养液A(羊膜上皮细胞向角质形成细胞方向诱导培养基)，其组分按500ml 体积计包括商用培养基DMEM 360ml、商用培养基F12 90ml、胎牛血清50ml、腺嘌呤180 260mM、胰岛素2 10ii g/ml、转铁蛋白5 10ii g/ml、表皮生长因子(EGF) 5 15ng/ml、氢化可的松0. 2 0. 5 ii g/ml ; 配制培养液B(间充质干细胞向毛乳头方向诱导培养基)，其组分按500ml体积计 包括商用培养基DMEM 300ml、商用培养基F12 125ml、胎牛血清75ml、 wnt3a蛋白50 150ng/ml、成纤维生长因子2(FGF-2)3 8ng/ml ; 配制培养液C(羊膜上皮细胞向汗腺上皮样细胞诱导培养基)，其组分按500ml体 积计包括商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、神经生长因子(NGF) 10 15ng/ml、表 皮生长因子5 15ng/ml、转化生长因子(TGF-P ) 10 20ng/ml、硫酸肝素糖蛋白50 100ng/ml ; 配制培养液D (组织工程真皮培养基)，其组分按500ml体积计包括商用培养基 DMEM 300ml、商用培养基F12 150ml、胎牛血清50ml、胰岛素样生长因子6 18ng/ml、表皮 生长因子5 15ng/ml、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含附属器的组织工程皮肤的制备方法，包括有细胞的获得、扩大培养、定向诱导分化，以及组织工程双层皮肤的制备，其特征在于：是在凝胶溶液中接种羊膜间充质干细胞、向毛乳头方向诱导的羊膜间充质干细胞、羊膜上皮细胞、向汗腺上皮方向诱导的羊膜上皮细胞，经真皮层的培养后，再经形成毛囊、汗腺结构的诱导培养，于其表面再接种羊膜上皮细胞和经向角质形成细胞诱导的羊膜上皮细胞，经组织工程双层皮肤的培养得到含有毛囊、汗腺结构的组织工程皮肤；其中，毛囊结构由向毛乳头方向诱导后的羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞共同构建，汗腺结构由向汗腺上皮方向诱导后的羊膜上皮细胞构建，以羊膜上皮细胞和向角质形成细胞方向诱导后的羊膜上皮细胞构建表皮层，以具有诱导形成毛囊、汗腺结构作用的凝胶溶液与羊膜间充质干细胞构建真皮层；所述的凝胶溶液含有细胞外基质和有诱导形成毛囊、汗腺结构作用的蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金岩，杨鹭，张勇杰，王爱军，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，陕西瑞盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]