一种外泌体的分离纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种外泌体的分离纯化方法。该分离纯化方法包括：(1)外泌体供体细胞培养液经过深层过滤和除菌过滤得到外泌体供体细胞培养上清液；(2)采用切向流过滤浓缩外泌体供体细胞培养上清液，得到浓缩液；(3)将浓缩液与全能核酸酶孵育后微滤得到粗提溶液；(4)将粗提溶液依次通过第一层析柱和第二层析柱进行层析分离，得到纯化后的外泌体溶液，其中，第一层析柱为采用具有分子筛功能、离子交换功能和疏水功能中的至少两种功能的多功能填料的填料柱，第二层析柱为阴离子交换膜层析柱。相比已有技术，本发明专利技术方法不仅外泌体纯度和质量有进一步提升，而且能够真正适用于工业化水平外泌体分离纯化。泌体分离纯化。泌体分离纯化。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体的分离纯化方法


[0001]本专利技术涉及一种外泌体的分离纯化方法。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡是由古细菌、细菌和真核生物的大多数细胞分泌的微小膜泡。细胞外囊泡作为纳米级别的双层封闭膜结构，包含脂质、RNA、代谢物、生长因子和细胞因子等成分，调节复杂的细胞通讯，以维持正常生理或引发严重的疾病进展。根据其生物发生机制，细胞外囊泡通常分为三种亚型：外泌体、微囊泡和凋亡小体，其中外泌体生物发生和分泌的机制是细胞质膜向内出芽并随后形成多囊泡体，多囊泡体与细胞质膜融合，分泌到胞外，形成直径在30～200nm的膜性囊泡。
[0003]外泌体可以被应用于许多领域，包括疾病诊断、疾病治疗、药物递送等。外泌体含有特点的蛋白质和RNA，可以用于早期诊断和预后评估。外泌体可以促进细胞再生和修复，可用于肝、肾等器官的再生治疗。外泌体还可以用于治疗心血管疾病、神经系统疾病、免疫系统疾病等。外泌体具有较小的体积和良好的穿透力，可以穿过血脑屏障和其他组织屏障，实现有效的药物递送。外泌体具有较好的稳定性和生物相容性，可避免外源性递送系统的不良反应和毒性。
[0004]外泌体的提取技术主要包括差速/超速离心法、超滤法、密度梯度离心法、化学沉淀法、尺寸排阻法、免疫捕获法、流场
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流分馏技术、微流法等。差速/超速离心法是基于密度和粒径的顺序分离，根据样品中外泌体、蛋白质、细胞碎片、细胞以及细胞器等物质沉降速度的差异，通过不同的离心力和离心时间，将外泌体上清液分离。差速/超速离心法的缺点是耗时长，设备成本高，外泌体可能会因高速离心而受损。超滤法是基于粒径分离，操作简单易放大，但易导致外泌体丢失，产量很低。化学沉淀法通过聚乙二醇(PEG)等，改变外泌体溶解度和分散性，使溶解性较低的组分从溶液中析出，其缺点是缺乏特异性、选择性，外泌体纯度低。尺寸排阻法是根据外泌体粒径大小利用色谱柱进行分离提取，重力流保留了外泌体的完整结构和生物活性，但是单独使用时耗时长，难以规模放大。免疫捕获法是基于使用特异性外泌体标记物的外泌体捕获，其缺点是试剂成本高，收率低，使用受限。流场
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流分馏技术基于粒径分离，缺点是样本量低，难以扩大规模。微流法基于免疫亲和、粒径和密度分离技术，缺点是样品处理量较低。密度梯度离心法利用外泌体与其他溶质的密度差异而实现分离，是目前外泌体提取的“金标准”，但是密度梯度有样品处理量小、耗时长以及难放大等特点。
[0005]对于最终应用于临床领域的外泌体，不仅需要保证外泌体的生物活性，还需要符合生物制剂安全性标准，宿主蛋白质、DNA、病毒和内毒素等必须减少到安全水平。完整外泌体为典型的茶杯状囊泡，从电镜观察外泌体溶液，应呈现明显的茶托状或杯状结构，边缘清晰且有一圈略微更明亮的亮圈，边缘清晰且不团聚。专利CN115354031A公开了一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，然而，其实际上并没有实现纯化的目的，其所公开的电镜图并未显示具有典型“茶杯”结构的外泌体存在，而且从背景可见存在较大量杂
质。而工业化外泌体分离纯化需要考虑工艺的可放大性，但更重要的还是保证外泌体纯度和生物活性，因此，该专利方法不能真正适于工业上规模化纯化外泌体。

技术实现思路

[0006]本专利技术所解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种真正适用于工业上规模化纯化外泌体的方法。
[0007]为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种外泌体的分离纯化方法，其包括以下步骤：
[0009](1)外泌体供体细胞培养液经过深层过滤和除菌过滤得到外泌体供体细胞培养上清液；
[0010](2)采用切向流过滤浓缩所述外泌体供体细胞培养上清液，得到浓缩液；
[0011](3)将所述浓缩液与全能核酸酶孵育后微滤得到粗提溶液；
[0012](4)将所述粗提溶液依次通过第一层析柱和第二层析柱进行层析分离，得到纯化后的外泌体溶液，
[0013]其中，第一层析柱为填料柱，且所采用的填料为多功能填料，所述多功能填料具有分子筛功能、离子交换功能和疏水功能中的至少两种功能，所述第二层析柱为阴离子交换膜层析柱。
[0014]优选地，步骤(1)中，所述细胞培养液的活细胞密度大于10
×
106cells/mL且细胞活力大于80％。
[0015]优选地，所述细胞培养液采用的培养基为无血清培养基。
[0016]根据一些优选实施方式，步骤(1)中，所述深层过滤载量为40～60L/m2，过滤流速为80～120LMH。
[0017]根据一些优选实施方式，步骤(1)中，所述除菌过滤采用膜孔径为0.2μm～0.25μm的除菌过滤器。
[0018]根据一些具体且优选地实施方式，步骤(1)中，所述深层过滤采用MD0HC054H1密理博深层过滤膜包。
[0019]根据一些具体且优选地实施方式，步骤(1)中，所述除菌过滤采用5441307H5G
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00除菌过滤器。
[0020]优选地，步骤(2)中，所述的切向流过滤采用截留分子量为100kDa～750kDa的中空纤维柱，例如100kDa、150kDa、200kDa、250kDa、300kDa、350kDa、400kDa、450kDa、500kDa、550kDa、600kDa、650kDa、700kDa、750kDa。
[0021]进一步优选地，步骤(2)中，所述的切向流过滤采用截留分子量为400kDa～600kDa的中空纤维柱。
[0022]优选地，步骤(2)中，所述浓缩的倍速为5～15倍，例如5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。
[0023]优选地，步骤(2)中，控制所述切向流过滤的跨膜压力为1.5～3psi，载量为40～60L/m2。
[0024]根据一些具体且优选地实施方式，步骤(3)中，将所述浓缩液与MgCl2溶液和全能核酸酶溶液混合得到孵育体系，控制所述孵育体系中MgCl2的浓度为0.5～2mM，全能核酸酶
的浓度为10～30U/mL。
[0025]根据一些优选实施方式，步骤(3)中，控制所述孵育的温度为25～37℃，控制所述孵育的时间为3～16h。
[0026]进一步优选地，步骤(3)中，控制所述孵育的温度为35～37℃，控制所述孵育的时间为3～5h。
[0027]根据一些优选实施方式，步骤(3)中，所述微滤采用膜孔径为0.2μm～0.25μm滤器。
[0028]优选地，所述多功能填料具有分子筛功能、离子交换功能和疏水三种功能。
[0029]根据一些具体且优选地实施方式，所述多功能填料为Capto Core 700和/或Capto Core 400。
[0030]根据一些具体且优选地实施方式，所述阴离子交换膜层析柱为Q膜层析柱或Pall Mustang Q XT膜层析柱。
[0031]优选地，步骤(4)中，通过所述第一层析柱进行的层析分离包括依次对所述填本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体的分离纯化方法，其特征在于：所述的分离纯化方法包括以下步骤：(1)外泌体供体细胞培养液经过深层过滤和除菌过滤得到外泌体供体细胞培养上清液；(2)采用切向流过滤浓缩所述外泌体供体细胞培养上清液，得到浓缩液；(3)将所述浓缩液与全能核酸酶孵育后微滤得到粗提溶液；(4)将所述粗提溶液依次通过第一层析柱和第二层析柱进行层析分离，得到纯化后的外泌体溶液，其中，第一层析柱为填料柱，且所采用的填料为多功能填料，所述多功能填料具有分子筛功能、离子交换功能和疏水功能中的至少两种功能，所述第二层析柱为阴离子交换膜层析柱。2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)中，所述细胞培养液的活细胞密度大于10
×
106cells/mL且细胞活力大于80％；和/或，所述细胞培养液采用的培养基为无血清培养基。3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)中，所述深层过滤载量为40～60L/m2，过滤流速为80～120LMH；和/或，所述深层过滤采用MD0HC054H1密理博深层过滤膜包；和/或，所述除菌过滤采用膜孔径为0.2μm～0.25μm的除菌过滤器。4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的切向流过滤采用截留分子量为100kDa～750kDa的中空纤维柱；和/或，所述浓缩的倍速为5～15倍；和/或，控制所述切向流过滤的跨膜压力为1.5～3psi，载量为40～60L/m2。5.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：步骤(3)中，将所述浓缩液与MgCl2溶液和全能核酸酶溶液混合得到孵育体系，控制所述孵育体系中MgCl2的浓度为0.5～2mM，全能核酸酶的浓度为10～30U/mL；和/或，控制所述孵育的温度为25～37℃，控制所述孵育的时间为3～16h；和/或，所述微滤采用膜孔径为0.2μm～0.25μm滤器。6.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：所述多...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨诗逸，翟艳华，崔闯，赵进修，何新军，许可，
申请(专利权)人：苏州唯思尔康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：