变构探针、荧光生物传感器、其制备方法及荧光检测方法技术

本发明专利技术提供变构探针、荧光生物传感器、其制备方法及荧光检测方法，该变构探针包括L链、P1链及P2链，L链与P1链及P2链形成T型结构变构探针，L链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本申请首次创新地利用特殊设计的变构探针，适配CRISPR/Cas9系统元件，为CRISPR/Cas系统实现多重信号输出提供了新的反应模型。本申请的方法仅需一种Cas蛋白，即可通过一锅法实现多重检测，极大程度上简化了操作步骤。极大程度上简化了操作步骤。极大程度上简化了操作步骤。

【技术实现步骤摘要】
变构探针、荧光生物传感器、其制备方法及荧光检测方法


[0001]本申请涉及生物
，具体涉及变构探针、荧光生物传感器、其制备方法及荧光检测方法。

技术介绍

[0002]临床上各类疾病的发生发展及预后过程中通常伴随着多种生物标志物的变化，这些标志物种类和数量的变化对于疾病的诊断和治疗有着至关重要的作用。因此，对疾病相关生物标志物的精确检测是诊断、预测疾病发生发展中关键的一环。目前，临床上已经开发了多类型的检测方法，其中化学发光、电化学发光是主流手段。但现有的大多数检测方法均局限于只能在一次分析中检测一种靶物质。若要实现多种靶标的同时检测，则需获取多份临床样本进行多次分析，这导致了成本和时间的增加。因此，开发一种能实现在单个样品中同时检测多个靶标的检测技术具有十分广阔的应用前景。
[0003]结构DNA自组装技术提供了调节和切换分子相互作用的多功能工具，该技术在碱基互补配对的基础上通过对DNA序列进行特异性的设计构建各类核酸纳米分子元件。利用核酸元件分析核酸靶标和非核酸靶标，如离子、代谢物、蛋白质、病毒、细胞和组织，源于其准确识别和转导目标信号的能力，以及输出信号的通用报告方法。在分子工程的帮助下，已生成了不同功能的核酸探针来进行目标识别。同时，详细了解核酸与其靶标之间的分子内和分子间相互作用，可进一步发展基于核酸的信号转导策略。此外，基于核酸的生物分析技术结合光学、电学、比色和声学技术可以多功能输出，并应用于不同的场景。
[0004]成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，CRISPR)是存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种适应性的免疫防御机制，由CRISPR相关蛋白(CRISPR associated protein,Cas)和单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA)组成。该系统近来不仅被用作转录调控和基因组编辑，而且还用于生物传感，包括检测RNA、病原体和小分子。CRISPR/Cas系统作为一种新型基因编辑工具在生物医学领域掀起了一阵热浪，其通过引导RNA靶向特定双链，激活具有内切酶活性的Cas蛋白，实现双链切割的能力，它的靶向识别剪切能力也同样在生物传感领域得到了关注。常用的Cas蛋白包括Cas9、Cas12a、Cas13a等，其主要差别在于识别序列与Cas酶活性的不同。如Cas9主要是识别特定序列后实现双链切割，而Cas12a和Cas13a则在双链切割后还分别具备单链DNA和RNA的侧切活性。研究者已利用CRISPR/Cas系统开发了一系列核酸、蛋白以及小分子等生物标志物传感检测技术。
[0005]但是，现阶段在众多分析技术中，CRISPR/Cas生物传感技术的一个主要缺点是缺乏多重检测的应用，其原因在于多重分析中不同的编码信号在检测时需互不干扰，而单个引导RNA对应的靶核酸序列的唯一性与多重检测之间存在着矛盾，且Cas12a和Cas13a无序的反式裂解活性限制了其在多重分析中的应用。现已开发的一些多重CRISPR/Cas系统检测技术中，研究者通过使用不同的Cas蛋白联合构建多重检测体系，但是不同种Cas蛋白反应体系的最佳条件是互不相同的，这会使这种技术难以实现一锅法，还有研究者通过所检测
的靶标设计相应的多种引导sgRNA来实现多重的一个应用，这种设计增加了体系的复杂性。
[0006]因此，开发一种利用CRIPR/Cas系统，以在单样品中实现多个生物疾病标志物的同时检测，并兼备高灵敏、高特异的临床诊断新技术，具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0007]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术提供变构探针、荧光生物传感器、其制备方法及荧光检测方法。
[0008]在本申请的一实施例中，本专利技术提供一种变构探针，所述变构探针包括L链、P1链及P2链，所述L链与所述P1链及P2链形成T型结构变构探针，所述L链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
[0009]在本申请的一实施例中，所述P1链和P2链均掺入有错配碱基。
[0010]在本申请的一实施例中，所述P1链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]在本申请的一实施例中，所述P2链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0012]在本申请的一实施例中，本专利技术还提供一种荧光生物传感器，所述荧光生物传感器包括如权利要求1
‑
4任一项所述的变构探针、Cas9蛋白及sgRNA。
[0013]在本申请的一实施例中，本专利技术还提供如上所述的荧光生物传感器的制备方法，所述制备方法包括：
[0014]向缓冲液中加入预先配制的P1链溶液、P2链溶液及L链，得到混合液，随后变性退火、孵育，构建得到所述荧光生物传感器。
[0015]在本申请的一实施例中，所述变性退火包括：先于90
‑
100℃处理5
‑
10min，接着以0.5
‑
1.5℃/min的速率降温至4℃。
[0016]在本申请的一实施例中，所述孵育包括：先于25
‑
37℃温度下预孵育5
‑
15min，接着于25
‑
37℃下避光孵育15
‑
30min。
[0017]在本申请的一实施例中，本专利技术还提供一种荧光检测方法，采用如上所述的变构探针探针和/或如上所述的荧光生物传感器和/或如上所述的方法制备得到的荧光生物传感器。
[0018]在本申请的一实施例中，所述荧光检测方法，包括以下步骤：
[0019]S1.石英比色皿清洗：将石英比色皿用酒精浸泡后清洗；
[0020]S2.设置参数：设置激发波长为490nm，接收波长范围为500
‑
600nm，电压为800V；
[0021]S3.调零：向石英比色皿中加入蒸馏水，进行调零；
[0022]S4.检测：将反应加入荧光比色皿中，点击检测，即可获得荧光信号。
[0023]本专利技术的有益效果：
[0024]本申请首次创新地利用特殊设计的变构探针，适配CRISPR/Cas9系统元件，为CRISPR/Cas系统实现多重信号输出提供了新的反应模型。
[0025]现有技术中，大多基于CRISPR/Cas的多重检测需要多种Cas蛋白联用结合，从而需要多步法反应以实现最优条件，本申请的方法则仅需一种Cas蛋白，即可通过一锅法实现多重检测，极大程度上简化了操作步骤。
[0026]本申请利用靶标特异性loop环引入sgRNA识别双链序列中，实现了由单一sgRNA引导的多重检测体系，一定程度上降低了检测体系设计的复杂性和检测的成本。
[0027]本专利技术的变构探针可根据检测靶标的不同进行相应的设计，具有通用性。
附图说明
[0028]图1为本申请的变构探针的设计原理图；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种变构探针，其特征在于，所述变构探针包括L链、P1链及P2链，所述L链与所述P1链及P2链形成T型结构变构探针，所述L链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。2.如权利要求1所述的变构探针，其特征在于，所述P1链和P2链均掺入有错配碱基。3.如权利要求2所述的变构探针，其特征在于，所述P1链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。4.如权利要求2所述的变构探针，其特征在于，所述P2链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。5.一种荧光生物传感器，其特征在于，所述荧光生物传感器包括如权利要求1
‑
4任一项所述的变构探针、Cas9蛋白及sgRNA。6.权利要求5所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：向缓冲液中加入预先配制的P1链溶液、P2链溶液及L链，得到混合液，随后变性退火、孵育，构建得到所述荧光生物传感器。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述变性退火包括：先于90
‑
100℃处理5

【专利技术属性】
技术研发人员：丁世家，胡芮维，吴海平，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：