本发明专利技术公开了一种转肽酶Sortase A及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。所述的转肽酶能够识别C端含有保守氨基酸序列LPXTG、N端含有多聚甘氨酸的蛋白质，其中X为除半胱氨酸、色氨酸以外的任意氨基酸。所述的转肽酶中位于184位的半胱氨酸攻击底物识别序列LPXTG中的苏氨酸/甘氨酸之间的肽键，使肽键发生断裂，在酶与底物之间形成酰基酶中间体，多聚甘氨酸攻击酰基酶中间体，在底物与多聚甘氨酸之间形成新的肽键。本发明专利技术的转肽酶Sortase A纯度达到95％以上，转肽酶Sortase A的浓度较高并且具有较好的转肽效果。有较好的转肽效果。有较好的转肽效果。
【技术实现步骤摘要】
一种转肽酶Sortase A及其制备方法和应用
[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种转肽酶Sortase A及其制备方法和应用。
技术介绍
[0002]转肽酶是一类介导革兰氏阳性菌细胞壁锚定蛋白与细胞壁共价结合的酶，是由206个氨基酸组成的多肽。转肽酶在细菌中有两种不同的功能，包括将表面蛋白锚定在细胞壁上和组装从微生物表面伸出来的长蛋白纤维。
[0003]根据大多数转肽酶同源物的原始序列，可将转肽酶分为A
‑
F类6个不同的亚类。A类，B类和D类酶普遍存在于厚壁菌中。转肽酶A(Sortase A，SrtA)是一种膜结合的半胱氨酸转肽酶，含有His
‑
Cys
‑
Arg催化三联体，主要序列含有一个高度保守的TLXTC基序，该基序含有催化必需的半胱氨酸残基。
[0004]转肽酶Sortase A负责表面蛋白与革兰氏阳性菌细胞壁的共价锚定，能够催化含有Leu
‑
Pro
‑
X
‑
Thr
‑
Gly(LPXTG，X是任意氨基酸)基序的表面蛋白毒性因子共附着在革兰氏阳性菌的细胞壁上。在表面蛋白的锚定过程中，转肽酶利用两种底物，底物包括分泌蛋白。分泌蛋白的N端包含有一个分泌信号肽，C端包含有一个LPXTG结构域，N端的信号肽会指引分泌蛋白通过分泌运至细胞外。结合在细胞膜上的Sortase A会切割LPXTG基序中T和G之间的共价键，形成硫酯酶中间体，中间体将表面蛋白共价结合到肽聚糖上，表面蛋白通过转糖苷作用和转肽作用整合到细胞壁上，Sortase A通过上述的作用方式，将蛋白锚定到细菌细胞壁上。
[0005]中国专利CN201610465810.3中公开了一种应用转肽酶Sortase A修饰蛋白的方法，该专利技术利用可以特异性吸附转肽酶Sortase A的磁珠，将Sortase A固定到磁珠上，将其用于催化蛋白或短链连接、修饰反应。该专利利用制备的Sortase A结合磁珠的方法相比于游离酶，Sortase A结合磁珠后至少可循环利用5次，且提高了催化产率。
[0006]中国专利CN201510440032.8中公开了一种高效分泌表达转肽酶Sortase A的方法，该专利技术通过对目的蛋白载体以及发酵体系中添加剂和添加策略的优化，表明pET
‑
22b载体是适合Sortase A胞外生产的载体，采取两个阶段添加甘氨酸可以极大的提高大肠杆菌胞外生产Sortase A的水平。
[0007]目前，现有技术中并未公开本专利技术中SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白作为转肽酶A的应用，本专利技术中为首次公开该蛋白作为转肽酶A的应用。
技术实现思路
[0008]本专利技术的目的是提供一种如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白作为转肽酶的应用。
[0009]为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0010]第一方面，本专利技术提供了一种包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白作为转肽酶的应用。
[0011]优选地，所述的转肽酶在SEQ ID NO:1的基础上添加His标签并进行点位突变。
[0012]进一步优选地，所述的转肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0013]具体地，所述的转肽酶为转肽酶Sortase A。
[0014]具体地，所述的标签用于纯化上述的重组蛋白。
[0015]进一步具体地，所述的纯化为组氨酸特异性的结合镍离子，带有His标签的重组蛋白可以被镍柱吸附，从而纯化重组蛋白。
[0016]具体地，所述的转肽酶Sortase A能够识别C端含有保守氨基酸序列LPXTG、N端含有多聚甘氨酸的蛋白质。
[0017]进一步具体地，所述的LPXTG中X为除半胱氨酸、色氨酸以外的任意氨基酸。
[0018]具体地，所述的转肽酶Sortase A中位于184位的半胱氨酸攻击底物识别序列LPXTG中的苏氨酸/甘氨酸之间的肽键，使肽键发生断裂，在酶与底物之间形成酰基酶中间体，多聚甘氨酸攻击酰基酶中间体，在底物与多聚甘氨酸之间形成新的肽键，完成转肽反应如图1所示。
[0019]具体地，所述的转肽酶Sortase A的制备方法，包括以下步骤：
[0020](1)合成全基因序列，将序列连接表达载体，再将其转化表达工程菌，获表达菌株；
[0021](2)将步骤(1)中获得表达菌株接种到培养基中，加入诱导剂，离心，收集菌体；
[0022](3)将步骤(2)中菌体经过破菌，粗酶处理后获得所述的转肽酶Sortase A。
[0023]优选地，步骤(1)中所述的全基因序列如SEQ ID NO:3所示。
[0024]具体地，步骤(1)中所述的表达载体为pET
‑
32a。
[0025]优选地，步骤(1)中所述的工程菌为BL21(DE3)。
[0026]进一步具体地，所述的步骤(1)中所述的转化包括以下步骤：
[0027](A)将表达质粒置于BL21感受态细胞中，混匀，冰浴。
[0028](B)水浴42℃热激45s后，冰浴2
‑
3min。
[0029](C)加入培养基，在37℃，150rpm条件下，培养1h。
[0030](D)取培养物涂布至平板中，37℃，过夜培养。
[0031]再进一步具体地，步骤(A)中所述的感受态细胞选自BL21感受态细胞、DH5α感受态细胞、JM109感受态细胞中的一种或多种。
[0032]更进一步具体地，步骤(A)中所述的感受态细胞为BL21感受态细胞。
[0033]再进一步具体地，所述的培养基选自LB培养基、TB培养基、SOB培养基中的一种或多种。
[0034]更进一步具体地，所述的培养基为LB培养基。
[0035]具体地，步骤(2)中所述的表达菌株与培养基的比例为1：30
‑
50；
[0036]进一步具体地，步骤(2)中所述的表达菌株与培养基的比例为1：50。
[0037]具体地，步骤(2)中所述的培养的温度为35
‑
37℃，所述的培养为振荡培养，所述的振荡培养的振荡频率为250rpm，培养至OD600＝0.8
‑
1.0。
[0038]具体地，步骤(2)中所述的诱导剂选自异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、阿拉伯糖中的一种或多种。
[0039]进一步具体地，步骤(2)中所述的诱导剂为IPTG。
[0040]进一步具体地，所述的诱导剂IPTG的浓度为0.5
‑
2mM；
[0041]再进一步具体地，所述的诱导剂IPTG的浓度为1mM。
[0042]具体地，步骤(2)中所述的加入诱导剂后培养的温度为20
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白作为转肽酶的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的转肽酶在SEQ ID NO:1的基础上添加His标签并进行点位突变，所述的转肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的转肽酶的制备方法，包括以下步骤：(1)合成全基因序列，将序列连接表达载体，再将其转化表达工程菌，获表达菌株；(2)将步骤(1)中获得表达菌株接种到培养基中，加入诱导剂，离心，收集菌体；(3)将步骤(2)中菌体经过破菌，纯化处理后获得所述的转肽酶。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述的表达载体为pET
【专利技术属性】
技术研发人员：吕兰，胡月，邢亚东，何胜祥，
申请(专利权)人：江苏同科医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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