一种用于高效发酵制备红景天苷与酪醇的工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，具体涉及了一种用于高效发酵制备红景天苷与酪醇的工程菌及其应用，通过敲除酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)trp2、trp3两个色氨酸合成基因以及aro8与aro9这两个芳香族氨基酸转移酶基因；进化aro1基因得到aro1evo基因；强化表达aro1evo、aro10、tyr1基因；敲入ugt85A1基因，构建重组酿酒酵母。本发明专利技术基因工程菌株可以高效发酵生产红景天苷与酪醇，经济价值高，适用于工业化生产。工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种用于高效发酵制备红景天苷与酪醇的工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及了一种用于高效发酵制备红景天苷与酪醇的工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]红景天苷(Salidroside)是一种景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiol L)植物最为重要的药效成分，临床研究结果表明，红景天苷不但有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射、抗病毒、抗肿瘤等明显功能，而且还具有增强注意力、提高工作效率、延缓机体衰老、防止老年疾病等功效，尤其在军事医学、航天医学、运动医学和保健医学等方面具有十分重要的应用价值，是一种极具开发前景的环境适应药物，药理研究表明，红景天苷具有抗病毒、外伤机体修复、脑缺血保护、调节神经退行性疾病、保护心脑血管、保肝护肝等作用，对慢性阻塞性肺疾病、高原红细胞增多症、糖尿病和癌症等疾病均有显著的治疗功效。
[0003]酪醇(Tyrosol)是对羟基苯乙醇的中文别称，是一种天然的抗氧化剂，来源于橄榄油，同时也是橄榄油的活性有效成分。临床研究结果表明，酪醇具有较强的降糖、抗炎与心脑血管基因预防作用。
[0004]红景天苷(Salidroside)，化学名为2
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(4
‑
hydroxypHenyl)ethyl
‑
β
‑
D
‑
glucopyranoside，分子式为C
14
H
20
O7，分子量为300.304，CAS号为10338/>‑
51
‑
9，结构式如下。
[0005][0006]酪醇(Tyrosol)，化学名为为2
‑
(4
‑
Hydroxyphenyl)ethanol，分子式为C8H
10
O2，分子量为138.164，CAS号为501
‑
94
‑
0，结构式如下。
[0007][0008]目前，根据文献报道，红景天苷的制备方法主要为植物提取、化学合成与生物合成三种不同的工艺路线。然而，植物提取受到了植株栽培周期较长、植株中红景天苷含量较低且提取物中含有对人体有害的百脉根苷等诸多不利因素的影响而成本颇高。化学合成虽然能够一定程度上解决植物提取带来的诸多问题，但依旧存在环境不友好、操作难度大等产业化难题。生物合成不仅能够完美解决植物提取、化学合成的问题，且极为高效安全，是最为适合红景天苷工业化生产技术路线。
[0009]黄秋岚等人在《利用酿酒酵母生产红景天苷的初步探索》(山东大学，2021年第02期)中，介绍了一种通过基因工程手段，异源表达了拟南芥来源的AtUGT85A1成功实现了利用酿酒酵母发酵生产红景天苷。虽然该团队红景天苷产量依旧停留于50mg/L左右的水平，并不能满足产业化的需求。但其使用国际公认的具有较高生物安全性的底盘——酿酒酵
母，发酵生产红景天苷，提供了较为出色的思路。
[0010]毕慧萍等人在《一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株及其应用》(CN104946575B，首次公开日2015
‑
09
‑
30)中，介绍了一种通过基因工程手段强化大肠杆菌ppsA、tktA、aroB、aroD、aroE和aro10基因，成功实现利用大肠杆菌发酵生产红景天苷和淫羊藿次苷D2，但其红景天苷产量依旧仅有50mg/L左右的水平。
[0011]由于在单一菌株中进行红景天苷合成过程中受到UDP
‑
G的生成量限制，针对性改造后依旧产量不高。Liu等人在《Convergent engineering of syntrophic Escherichia coli coculture for efficient production of glycosides》(Metabolic Engineering 47,2018,243
‑
253)中报道了一种通过对大肠杆菌(E.coli)的碳源利用途径和酪醇生物合成途径进行改造，获得了利用木糖生产酪醇的大肠杆菌工程菌株AG和以葡萄糖为碳源生成UDP
‑
G并表达葡萄糖苷转移酶的大肠杆菌工程菌株GD。将AG与GD进行共培养成功实现了红景天苷6.03g/L的发酵产量。其中UDP
‑
G为尿嘧啶核苷二磷酸葡萄糖，具有如下结构：
[0012][0013]红景天苷是酪醇与尿嘧啶核苷二磷酸葡萄糖在糖基转移酶的催化下形成的糖基化产物。具有较好的抗氧化、抗高反功效，是一种具有巨大潜在价值的中医药活性成分。采用糖基转移酶为催化剂进行转化，已成为目前红景天苷合成的主要研究热点，利用糖基转移酶较高的效率，可将葡萄糖残基高效地转移到底物酪醇分子上，实现底物酪醇高效转化，符合酪醇分子转化的原子经济效益(赵广荣等，CN107460203B，首次公开日：2017
‑
12
‑
12；何冰芳等，Scientificreports,2017,7(1):463；刘涛等，CN109321615B，首次公开日：2019
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02
‑
12)。目前，以糖基转移酶(或含糖基转移酶的基因工程菌株)为催化剂进行红景天苷合成的方法，已取得显著进展，具有理想的工业应用前景，然而糖基转移酶仍是红景天苷生物合成系统中的限速步骤，同时能够高产酪醇的基因工程菌株及基因工程菌株大规模发酵时的稳定性(基因工程菌大规模发酵时容易丢失外源插入的质粒，从而丧失催化活力)，以及对底物分子的适应性及耐受性，仍是制约红景天苷生物合成的瓶颈。因此开发具有高效糖基转移活性，酪醇高产菌株且对催化体系(含前体分子及溶剂等)具有较高耐受性的野生型菌株，有望创建高效合成红景天苷的策略，解决红景天苷稀缺的问题。

技术实现思路

[0014]为了解决现有技术中存在的问题，本申请的专利技术人使用定向进化、基因工程等技术对酿酒酵母工程菌株INVSc1进行改造，得到了一株高产红景天苷的菌株。
[0015]优选的，为了获得酪醇高产菌株，需要对底盘细胞的分支酸代谢途径进行强化；弱化色氨酸合成、苯丙氨酸合成、酪氨酸合成的分流；提升对羟基苯丙酮酸合成效率；在其内
源性的醇脱氢酶的作用下使代谢流集中于酪醇合成。
[0016]优选的，使用定向进化技术及基因工程技术，改造分支酸代谢中aro1基因，同时增加其拷贝数，实现强化分支酸合成代谢同时弱化色氨酸合成代谢的目的。
[0017]优选的，利用其基因组中现有的aro8与aro9前端的启动子，使用内源性aro10、tyr1基因进行替换，可一步实现截断苯丙酮酸
→
苯丙氨酸、对羟基苯丙酮酸
→
酪氨酸途径，同时强化酪醇合成途径，达到高效合成酪醇的目的。
[0018]进一步地，生产红景天苷需要高效的糖基转移酶，催化尿嘧啶核苷二磷酸葡萄糖与酪醇合成红景天苷。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产酪醇的工程菌，其特征在于，原始亲本为INVSc1，使用定向进化技术及基因工程技术得到的aro1evo基因替换原有aro1基因、trp2基因，使用其内源性aro10基因替换aro8基因和使用内源性tyr1基因替换aro9基因，其中所述aro1evo基因核苷酸序列为SEQ ID NO:17，所述aro10基因核苷酸序列为SEQ ID NO:18。2.一种构建权利要求1所述生产酪醇的工程菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.利用饱和突变及定点突变技术，对内源性aro1基因进行改造，提高其酶活性，进化后的aro1基因替换原有aro1基因、trp2基因得到强化分支酸合成代谢菌株；S2.在S1的基础上，利用Crispr/Cas9技术，使用其aro10基因替换aro8基因、内源性tyr1基因替换aro9基因得到所述生产酪醇的工程菌株。3.一种生产红景天苷的工程菌，其特征在于，在权利要求1所述工程菌的基础上插入ugt85A1基因替换内源性trp3基因，其中所述ugt85A1基因核苷酸序列为SEQ ID NO:16。4.一种构建权利要求3所述生产红景天苷的工程菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1a.以权利要求2得到的生产酪醇的工程菌株为底盘细胞；S3.在S1a所述工程菌株基因组中插入ugt85A1基因替换内源性trp3基因得到所述生产红景天苷的工程菌株。5.一种发酵制备红景天苷或酪醇的方法，其特征在于，S4.将权利要求1或权利要求3所述工程菌株扩大培养，并转接于种子培养基中制备种子液；S5.将种子液接种到摇瓶发酵培养基中，发酵获得发酵液；S6.将“S4”制备的种子液转接入新的种子培养基中，扩大培养；S7.将“S6”制备的种子液转接入5L发酵罐，发酵获得发酵液；S8.将“S6”制备的种子液转接入50L种子罐，扩大培养；S9.将“S8”制备的种子液转接入500L发酵罐，发酵获得发酵液；S10.处理发酵液，纯化获得红景天苷或酪醇。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，“S4”中，根据目标产物不同可选择权利要求1所述工程菌株或权利要求3所述工程菌株，接种于YPD固体培养基平板上，28.0～32.0℃培养24～48h。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，“S5”中，将培养完成的种子液以1％～30％的接种量转接入摇瓶发酵培养基中，28.0～32.0℃，200～300rpm培养72～96h。培养期...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴保中，李伟康，李晚军，王晨羽，张伟，王文涛，胡炜杰，廖永康，王凯航，
申请(专利权)人：安徽普利药业有限公司，
类型：发明
国别省市：