对虾肝胰腺细小病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种对虾肝胰腺细小病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法。本发明专利技术的检测试剂盒包括：采样管、内装蒸馏水的漂洗管、内装ＴＥ缓冲液的核酸变性管、内装扩增反应液和核酸染料的扩增检测管、阴性对照管、阳性对照管、ＦＴＡ膜片及其快速干燥液等。本发明专利技术的检测方法具有比ＰＣＲ检测方法更高的特异性、灵敏性和便捷性，并且成本低，使用方便，检测更准确、快速、灵敏度极高，且对人和环境都非常安全，可以替代已有的相关检测方法如病理切片法、电镜观察法和ＰＣＲ检测法。本发明专利技术的检测试剂盒和检测方法不仅可在室内的实验室使用，也可在野外的生产现场使用，对加强对虾肝胰腺细小病毒的流行病学监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及海洋生物病原检测技术，具体是对虾肝胰腺细小病毒对虾肝胰腺细小病毒Ofepatopancreatic Parvovirus，简称HPV)的现场快速高灵敏检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
对虾肝胰腺细小病毒，又名DNA细小病毒(Parvovirus)，属细小DNA病毒科 (Parvoviridae)细小DNA病毒属(Parvovirus)的一种单链DNA病毒。HPV可以感染中 国对虫下(Fenneropenaeus chinensis)、南美白对虫下(Litopenaeus vannamei)、印度对虫下 (Fenneropenaeus indieus)、斑节对虫下(Penaeus mono don)、曰本囊对虫下(Marsupenaeus japonicus)、墨吉对虫下(Fenneropenaeus merguiensis)、褐虎对虫下(browntigerprawn, Penaeus esculentus)、长毛对虫下(Fenneropenaeus penicillatus)、短沟对虫下(Penaeus semisulcatus)及蓝对虫下(blue shrimp,Litopenaeusstylirostris)等多种重要经济对虫下 及野生对虾。对虾感染该病毒之后，一般外观无明显特异症状，但免疫力、抗逆性会变差，常 会引发二次性细菌感染，或合并斑节对虾杆状病毒(Monodon Baculoviru^MBV)、白斑综合 症病毒(White Spot是Syndrome Virus, WSSV)感染，进而造成大量死亡，累计死亡率可达 50 90% ；感染该病毒的对虾也可并随着虾体增长，病情减轻；后一种感染会造成种虾隐 性感染而使种苗继续带毒。2009年我们在全国养殖对虾病毒病流行情况调查中发现，我国 沿海主要对虾养殖省份都能监测到HPV的存在和流行。所以开发新的技术快速、准确、灵敏 地检测HPV，加强对虾苗种和成虾检疫以及养殖水体环境的监测，对预防病毒感染，切断病 毒传播，保障我国对虾养殖业的健康持续发展具有重要意义。目前，有关HPV检测还主要依赖于病理切片法、电镜观察法和PCR检测法。病理切 片法不能直接对病毒进行检测，只能利用发病的组织病理征兆进行检测，并且还局限于在 实验室内进行；电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费 时间长、准确性低；HPV的PCR检测法，虽然克服了前面几种方法的缺点，在实验室条件下能 实现对HPV的相对快速、准确检测，但由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和 成像系统，使得PCR检测法难以用于现场的快速检测，这大大限制了 PCR检测方法在现场生 产中的推广应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供一种适于生产现场应用、快速、高灵敏度且易操作的对虾 肝胰腺细小病毒检测方法，并将检测方法标准化，同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中， 以克服现有技术的不足，使HPV的检测更准确、灵敏、快速、安全和方便。首先，本专利技术利用针对HPV结构蛋白基因中保守区段设计的4条特异引物和一种 具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒定温度下对目的核酸进行扩增，实现对HPV的快速和高灵敏检测。为了进一步缩短检测时间、消除检测过程中可能发生的污染、简化检测步骤，使 检测实验能够在生产现场开展，本专利技术对HPV的实验室检测方法进行了优化。在用FTA卡 片制备样品核酸的标准步骤中，需要将被样品勻浆液润湿的FTA膜片在室温下干燥至少一 个小时，然后才能进行漂洗；本专利技术通过在被样品勻浆液润湿的FTA膜片上滴加亲水性且 易挥发的醇类物质(主要是叔醇、伯醇和仲醇)，使润湿的FTA膜片在室温条件下只需10分 钟即可完成干燥过程，大大缩短了样品核酸制备的时间。在利用等温扩增方法检测病原时， 目前普遍采用扩增反应结束后向反应管中添加核酸染料以判断检测结果的方法；由于等温 扩增反应的产物量非常大，这种打开反应管再添加核酸染料的方法极易导致后续待检样品 被污染而使检测结果出现假阳性；有报道和专利采用在扩增反应试剂中添加尿嘧啶DNA糖 基化酶(UNG酶)的方法消除污染风险，但却增加了成本；本专利技术先将核酸染料粘附到扩增 反应管的内侧上方或盖子内侧，等扩增反应结束后再通过上下反复震荡使扩增反应液和核 酸染料混合，这样不打开扩增反应管就能完成扩增产物的染色，消除了打开扩增反应管再 添加核酸染料过程中反应液可能溅出造成后续样品被污染的风险。在用FTA卡片制备样品 核酸的标准步骤中，需要用Whatman公司(英国)专门的纯化试剂反复漂洗FTA膜片；本专利技术无需专门的纯化试剂，采用普通的蒸馏水漂洗即可完成FTA膜片的纯化， 这样不仅简化了检测实验的操作步骤，还降低了成本。为了使该方法在生产现场更具实用 性，本专利技术在上述优化的基础上，将检测HPV病毒所需的试剂与器材进行了组装，使之标准 化、配套化，形成了检测试剂盒。本专利技术的检测试剂盒包括 (1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；(2)漂洗管，内装蒸馏水；(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；(4)扩增检测管，内装扩增反应液和核酸染料，扩增反应液组成成分如下扩增引 物 HPV-Fl 和 HPV-Bl 各 1 2 μ M，扩增引物 HPV-F2 和 HPV-B2 各 0. 1 0. 4 μ M，dATP、dTTP、 dGTP 和 dCTP 各 0. 8 2. 0mM，MgCl24 10mM，Betaine (甜菜碱)0. 6 1. 2M, Tris-HCl 10 40mM, KCl 10 20mM，MgSO4I 4mM，(NH4) 2S046 12mM，Triton X-1000. 05 % 1· 0 %，具 有链置换活性的DNA聚合酶2 20U ；核酸染料为分子生物学研究中常用的核酸染料，包括 但不限于 SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldViewTM、GeneFinder 等；且核酸染料预先粘 附于扩增检测管管壁内侧上方或扩增检测管盖子内侧；(5)阴性对照管，内装无对虾肝胰腺细小病毒核酸的FTA膜片；(6)阳性对照管，内装吸附了对虾肝胰腺细小病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液，为亲水性且易挥发的醇类物质；(S)FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管分别封装于无菌袋中；(9)包装盒，内装一块有多个小孔的泡沫板或海绵块；(10)使用说明书。上述试剂盒中所述的扩增引物是根据HPV结构蛋白基因保守区序列设计的，其核 苷酸序列如下上游引物1 5 ‘ -GCGTATGCTTGTACTAATTCTGCTATTTTGATGGAGTAAGAGCAGCAAAC下游引物1 5 ‘ -GGATTTTCAGACAGCACAGAAATAGTFTTATTCTGTCCTTCTTCTTGGA上游引物 2 5 ‘ -ACAAAGTACAAACAGAGGAGAA下游引物2 5 ‘ -AATGCAATCTCAATAGCCAAT。用本专利技术的试剂盒检测对虾HPV的方法，按下列步骤进行(1)取样品对虾组织约0. 02 1. Og置于采样管中，用研磨棒将样品对虾组织磨碎 至浆状；(2)用研磨棒蘸取浆状的样品对虾组织将FTA膜片充分润湿；(3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对虾肝胰腺细小病毒现场快速高灵敏检测试剂盒，其特征是该检测试剂盒包括：（１）采样管，用来盛放、研磨待检样品；（２）漂洗管，内装蒸馏水；（３）核酸变性管，内装ＴＥ缓冲液；（４）扩增检测管，内装扩增反应液和核酸染料；（５）阴性对照管，内装无对虾肝胰腺细小病毒核酸的ＦＴＡ膜片；（６）阳性对照管，内装吸附了对虾肝胰腺细小病毒核酸的ＦＴＡ膜片；（７）快速干燥液；（８）ＦＴＡ膜片、研磨棒、牙签和吸管；（９）包装盒，内装一块有多个小孔的泡沫板或海绵块；（１０）使用说明书。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张庆利，黄倢，张铮，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]