八角莲的组培快速繁殖方法技术

本发明专利技术公开了一种八角莲的组培快速繁殖方法。包括外植体的选取与处理，诱导培养，增殖培养，生根培养，移栽等步骤。本发明专利技术以ＭＳ培养基为基础，加入了辅助剂：活性炭、６－苄基腺嘌呤、赤霉素、玉米素，用于八角莲丛生芽的诱导生长和壮苗生根两个关键阶段。采用本发明专利技术所提供的成套技术方法对八角莲进行组织培养和微繁，解决了八角莲难于快速繁殖及稳定生根的重要技术难题，达到了繁殖系数高，技术稳定的要求。可以为八角莲的工业化生产提供一种周期短、繁殖率高、成本低廉的育苗方法。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种八角莲的组培快速繁殖方法。
技术介绍
植物是药物的天然宝库，人们利用药用植物的历史源远流长，全世界约有75％的人口以植物作为治疗预防疾病的药物来源(邢建民，2001)。人类已经从植物中发现了许多具有高度生理活性的药物，目前从植物来源的药物占药物总量的25％以上(郑光植，1987)。我国的传统中草药已有数千年的历史，至今仍在我国和许多国家和地区广为使用。但由于传统的中草药获取方法是以采集和消耗大量的野生植物资源为代价的，当采集和消耗量超过自然资源的再生能力时，必然会导致物种的濒危甚至灭绝。同时随着自然生态环境的日益破坏，也进一步导致药用植物资源的匮乏。生物技术的蓬勃发展为从根本上改变传统药材的生产提供了一个崭新的方法，植物组织和细胞培养技术则是其中一个重要的手段。我国自1964年罗士韦教授首先报道了人参组织培养获得成功的研究成果以来，许多科学家先后从事了多种药用植物的组织培养研究。至今，我国药用植物的组织培养研究迅速发展。目前，世界各国对植物的药用开发和研究都十分重视，就以美国来说，其成药中有47％是以植物为原料制成的(谢启昆，1986)。为了解决药用植物的供需矛盾，人们采用人工栽培的方法扩大药源。但在人工栽培的药用植物中，有不少名贵药材等生产周期较长，如人参、黄连，如果以常规方法育种或育苗，需要花费很长的时间；另有一些药用植物如贝母、番红花等，因繁殖系数小、耗种量大，导致育种速度很慢，生产成本增加。所以利用植物组织培养技术解决药用植物的植株再生与繁殖问题迫在眉睫。近年来，国内外在这方面已做了大量工作，已成功离体培养获得试管植株的药用植物至少有200种，如云南黑节草、延龄草、高山红景天、莪术、水母雪莲、星花绣线菊、溪黄草、玉叶金花、辽东楤木等；其中包括一些具有抗癌有效成分的珍稀植物，如红豆杉、艾、黄杨、大戟属植物、长春花、米仔兰、狗牙花和香榧等。八角莲Dysosma versipellis(Hance)M.Cheng是小檗科Berberidaceae八角莲属Dysosma的多年生草本植物，分布于我国湖南、湖北、浙江、江西、云南、贵州、四川、河南及陕西等地。生长于海拔400-1400米山坡沟谷杂木林下湿润处或阴湿溪谷草丛中。花期4-6月，果期7-9月。八角莲是我国传统中药中著名药用植物，主要取其根状茎供药用，具有化痰及清热解毒之功效，广泛应用于祛瘀解毒，治跌打损伤、关节酸痛、虫蛇咬伤，咽喉肿痛和疮疖等症。在现代医药领域，八角莲是著名抗癌药物VP-16、VM-26的主要原料。研究表明，八角莲的根状茎和根富含鬼臼毒素、去氢鬼臼毒素和脱氧鬼臼毒素等有效成分(刘长军1997，陈敏亨1979)，其中主要有效成分是鬼臼毒素(Podophyllotoxin)，在植物体中含量可达1.4％，具有抗肿瘤、抗病毒等多种生理活性。但是天然成分鬼臼毒素的毒副作用太大，不适合直接临床药用(King1946)，而是通过化学修饰(Creaven.1975)生成鬼臼毒素衍生物VP-16、VM-26等抗癌药物，这两种药物临床测试具有广谱抗癌活性，对睾丸癌、白细胞癌、淋巴肉癌、神经胶质瘤、霍杰金氏症等多种癌症有特殊疗效，现在已经广泛应用于临床。但是由于八角莲对生境要求严格，加之多年来生态环境的破坏，适合其生长的环境越来越少；又由于其具有重要的药用价值，招到滥挖乱采、过度利用，再加上本身的繁育机制不良，导致野生八角莲的分布范围和数量锐减，濒于灭绝。现在八角莲已经被列为国家三级濒危保护植物。现有的八角莲野生资源根本难以满足日益增长的医药领域的需要。因此，为了满足日益增大的药用需求，同时保护八角莲的野生资源，利用组培快繁技术，实现人工栽培是最好的解决方法。然而，由于野生八角莲对生境要求苛刻，繁殖机制不良，不仅是导致其濒危的原因，而且导致常规的组织培养技术十分难于对其进行快繁。迄今为止，在国内外尚未见关于八角莲组织培养快繁成功的报道。我们通过大量试验，历时三年终于摸索出一套成熟的方法，成功实现了八角莲的组培快繁，可以快速培育出大量幼苗，为实现工业化人工栽培八角莲提供可能。八角莲的组培快繁技术方法的成功建立，可以为大规模人工栽培药用植物八角莲提供种苗，为现代科技农业提供了一种切实可行的开发项目。参考文献邢建民，赵修德等.2000，水母雪莲细胞生物反应器悬浮培养.植物学报，42(1)98-101. 郑光植.1987，植物次生代谢细胞工程研究的新进展第六届国际植物组织与细胞培养会议评述.植物生理学通讯，(2)75-79. 谢启昆.1986，药用植物组织培养.上海，上海科学技术出版社.刘长军，侯嵩生.1997，抗癌活性物质鬼臼类木脂素的研究进展.天然产物研究与开发，9(3)81～89. 陈毓亨.1979，我国鬼臼类植物资源的研究.药学学报，14(2)101-106King L S，et al.1946，The similarity of the effect of podophyllin and colchicine andtheir use in the treatment of condylomata acuminata acuminata.Since，104244.Creaven P J，etal.1975，PTG a new antineoplastic epipodophyllotoxin，ibid，18227. Damayanthi Y.，Lown JW，1998，Curr.Med.Chem.，5(3)205文中所提及的缩写字母的意义见如下缩略词表MSMurashige and Skoog mediumMS培养基2，4-D2，4-dichlorophenoxy acetic acid 2，4-二氯苯氧乙酸NAA α-naphthal acetic acid α-萘乙酸IAA indole-3-acetic acid 引哚乙酸BA6-benzylaminopurine 6-苄氨基嘌呤KTkinetin 激动素GAgibberellic acid 赤霉素ACactivated charcoal活性炭PVP polyvinglypyrrolidon 聚乙烯吡咯烷酮ZTzeatin玉米素IBA indolebutyic aci 引哚丁酸
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种八角莲的组培快速繁殖方法。方法的步骤如下1)外植体的选取与处理选用八角莲的芽作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75％酒精中处理10-30秒，然后在经0.1-0.15％的升汞(Hgcl)消毒1-10分钟后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，接种于培养基中；2)诱导培养使用MS+BA(0.2-0.5mg/l)+ZT(0-1.0mg/l)作为诱导培养基，将所选取的芽接种于上述培养基中；3)增殖培养将生长于诱导培养基上外植体转接于MS+BA(0.2-1.0mg/l)+ZT(0-0.5mg/l)+GA(0-0.2mg/l)+PVP(0-0.5mg/l)上进行连续培养。4)生根培养选择1/2 MS+BA(0.2-0.5mg/l)+ZT(0.1-0.5mg/L)作为生根培养基；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种八角莲的组培快速繁殖方法，其特征在于：１）外植体的选取与处理：选用八角莲的芽作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗１０－３０分钟后，置于７５％酒精中处理１０－３０秒，然后在经０．１－０．１５％的升汞（Ｈｇｃｌ）消毒１－１０分钟后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，接种于培养基中；２）诱导培养：使用ＭＳ＋ＢＡ（０．２－０．５ｍｇ／ｌ）＋ＺＴ（０－１．０ｍｇ／ｌ）作为诱导培养基，将所选取的芽接种于上述培养基中；３）增殖培养：将生长于诱导培养基上外植体转接于ＭＳ＋ＢＡ（０．２－１．０ｍｇ／ｌ）＋ＺＴ（０－０．５ｍｇ／ｌ）＋ＧＡ（０－０．２ｍｇ／ｌ）＋ＰＶＰ（０－０．５ｍｇ／ｌ）上进行连续培养；４）生根培养：选择１／２ＭＳ＋ＢＡ（０．２－０．５ｍｇ／ｌ）＋ＺＴ（０．１－０．５ｍｇ／Ｌ）作为生根培养基；５）移栽：将已生根的植株取出，移栽到珍珠岩∶泥炭土（１∶１－１．５）混合的基质上。

【技术特征摘要】
1.一种八角莲的组培快速繁殖方法，其特征在于1)外植体的选取与处理选用八角莲的芽作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75％酒精中处理10-30秒，然后在经0.1-0.15％的升汞(Hgcl)消毒1-10分钟后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，接种于培养基中；2)诱导培养使用MS+BA(0.2-0.5mg/l)+ZT(0-1.0mg/l)作为诱导培养基，将所选取的芽接种于上述培养基中；3)增殖培养将生长于诱导培养基上外植体转接于MS+BA(0.2-1.0mg/l)+ZT(0-0.5mg/l)+GA(0-0.2mg/l)+PVP(0-0.5mg/l)上进行连续培养；4)生根培养选择1/2 MS+BA(0.2-0.5mg/l)+ZT(0.1-0.5mg/L)作为生根培养基；5)移栽将已生根的植株取出，移栽到珍珠岩∶泥炭土(1∶1-1.5)混合的基质上。2.根据权利要求1所述的一种八角莲的组培快速繁殖方法，其特征在于所说的使用MS+BA(0.1-0.5mg/l)+ZT(0.5-1.0mg/l)作为诱导培养基，将所选取的芽接种于上述培养基中诱导培养基的PH值5.8±0.1，培养温度25±1℃，每天光照时间12-16时，光照强度1900-2300LX。3.根据权利要求1所述的一种八角莲的组培快速...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅承新，潘琦，姜维梅，陈士超，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]