基于滚环信号放大的Pax-5a基因检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术属于基因检测领域，涉及荧光生物分析，特别是指基于滚环信号放大的Pax

【技术实现步骤摘要】
基于滚环信号放大的Pax
‑
5a基因检测试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术属于基因检测领域，涉及荧光生物分析，特别是指基于滚环信号放大的Pax
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5a基因检测试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]作为最常见的人类恶性肿瘤疾病之一，急性淋巴细胞白血病（ALL）在儿童中的患病率最高。在美国，每年约有3,000至4,000人被诊断患有ALL，其中三分之二是2至5岁的儿童。Pax
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5是在造血系统中发现的唯一paired
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box（PAX）家族成员，它可以分为Pax
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5a，Pax
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5b，Pax
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5c，Pax
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5d和Pax
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5e。其中，Pax
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5a是最重要的，Pax
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5通常是指Pax
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5a。Pax
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5对于B细胞分化和发育非常重要，其异常表达可引起B淋巴细胞性白血病。然而，目前关于变异的Pax5基因检测及该基因在临床急性淋巴细胞白血病患者中的表达的研究较少。因此，开发一些简便有效的Pax
‑
5基因突变检测的试剂盒是非常迫切且极具生命学意义的。
[0003]本课题组前期为了提高检测核酸时信号的灵敏度，专利号CN114921547A公开了基于λ核酸外切酶选择性消化构建信号放大系统，在目标基因存在的时候，HP
‑
HCR的尾部DNA序列与Pax
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5a基因配对形成平末端。加入λ核酸外切酶后，从5
’
端开始逐渐消化发夹，将Pax
‑
5a序列从HP
‑
HCR上释放出来从而与下一个发夹探针结合，实现Pax
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5a的循环利用，达到第一步扩增的目的。同时，HP
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HCR被裂解生成单链触发链，引发杂交链式反应。H1链被触发链打开后，可以与H2链序列杂交。产生的杂交链又继续与新的H1和H2链结合，H1和H2上的荧光基团与猝灭基团相互远离，荧光信号恢复以实现Pax
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5a基因的第二次扩增。因此可以通过测量荧光强度来实现对急性白血病Pax
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5a基因的高灵敏检测。为了进一步提高急性白血病Pax
‑
5a基因的高灵敏检测，本课题组基于滚环扩增技术（RCA）与链置换信号放大技术（SDR）进一步进行深入研究，以期获得兼具高灵敏度和超稳特性的急性白血病Pax
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5a基因的检测试剂盒。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提出一种基于滚环信号放大的Pax
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5a基因检测试剂盒及其使用方法。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：基于滚环信号放大的Pax
‑
5a基因检测试剂盒，包括Pad
‑
lock、A1链、A2链、A3链、AP链、缓冲液体系、T4连接酶、Phi29 DNA聚合酶和dNTPs；其中Pad
‑
lock序列如SEQ ID No.1所示（CCCATGCCAACTCACTATACAACCTACTACCTCATACGACTGAGTCTC）；A1链序列如SEQ ID No.2所示（GTCTCCAACTGTGCTGA）；A2链序列如SEQ ID No.3所示（AGTAGGTTGTATAGTTTCCCTAGTAGTTAAC）；A3链序列如SEQ ID No.4所示（TCAGCACAGTTGGAGACGGGAAACTATACAACCTACTACCTCA）；
AP链序列如SEQ ID No.5所示（AGTAGGTTGTATAGTTTCCCGTCTCCAACTGTGCTGA）。
[0006]上述A1链的3
’
端修饰有FAM荧光基团。
[0007]上述A3链的5
’
端修饰有BHQ
‑
猝灭基团。
[0008]上述缓冲液体系包括T4缓冲液和Phi29缓冲液。
[0009]利用上述的Pax
‑
5a基因检测试剂盒非疾病诊断为目的的检测Pax
‑
5a基因的方法，包括以下步骤：（1）将浓度相同的三条DNA链A1，A2，A3在37 ℃条件下孵育90分钟以形成三链复合结构M；（2）将待测溶液与一定浓度的Pad
‑
lock在反应管中混合，加入缓冲液体系与T4连接酶，孵育一段时间；再加入Phi29 DNA聚合酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸，孵育一段时间，然后通过加热使酶失活；（3）向步骤（2）中的反应溶液加入一量的M，长DNA链AP，在在37 ℃条件下避光反应90分钟。然后进行荧光测定，代入标准曲线获得白血病基因Pax
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5a的浓度。
[0010]上述步骤（1）中A1链溶液、A2链溶液和A3链溶液的浓度均为1
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10μM、体积比为1:1:1。
[0011]上述步骤（2）中Pad
‑
lock溶液的浓度1
‑
10 μM；T4缓冲液的浓度为10 mM，pH为7.5；T4 DNA连接酶的浓度为5
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15U/μL；Pad
‑
lock溶液、T4缓冲液、T4 DNA连接酶、待测溶液和灭菌水的体积比为1:2:2:1:14。
[0012]上述步骤（3）中Phi29缓冲液的浓度为10 mM，pH为7.4；Phi29聚合酶的浓度为0.74
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2.2U/μL；dNTPs的浓度为10 mM；预反应液、Phi29缓冲液、Phi29聚合酶、dNTPs和灭菌水的体积比为20:3:3:2:2。
[0013]上述步骤（4）中M溶液中三链复合结构的浓度为10 μM；AP链溶液的浓度为10 μM；反应液、M溶液和AP链溶液的体积比为30:2:1。
[0014]上述步骤（5）中线性方程为F=2.0231C +70.5083，R2=0.9941；荧光测定的波长为492nm，发射范围502
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650nm。
[0015]本申请试剂盒的检测原理为：目标基因存在时，在T4连接酶与Phi29聚合酶的作用下会启动RCA反应，一方面形成大量目标基因序列参与循环，一方面产生大量引物序列开启链置换反应。由A1，A2，A3按一定比例混合制备成三链复合结构M，其中，A1的3
’
端修饰有荧光基团，而A3的5
’
端修饰有猝灭基团，当M形成后，荧光基团与猝灭基团相互靠近，荧光信号消失；在引物序列聚合出来的情况下，长DNA链AP辅助启动链置换反应，将A1，A2从A3上置换下来，荧光基团与猝灭基团相互原理，荧光信号恢复。荧光信号强度与目标基因浓度有确定的关系，从而实现对急性白血病基因Pax
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5a的灵敏检测。
[0016]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于滚环信号放大的Pax
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5a基因检测试剂盒，其特征在于：包括Pad
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lock、A1链、A2链、A3链、AP链、缓冲液体系、T4连接酶、Phi29 DNA聚合酶和dNTPs，其中Pad
‑
lock序列如SEQ ID No.1所示、A1链序列如SEQ ID No.2所示、A2链序列如SEQ ID No.3所示、A3链序列如SEQ ID No.4所示、AP链序列如SEQ ID No.5所示。2.根据权利要求1所述的基于滚环信号放大的Pax
‑
5a基因检测试剂盒，其特征在于：所述A1链的3
’
端修饰有FAM荧光基团。3.根据权利要求2所述的基于滚环信号放大的Pax
‑
5a基因检测试剂盒，其特征在于：所述A3链的5
’
端修饰有BHQ
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猝灭基团。4.根据权利要求3所述的基于滚环信号放大的Pax
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5a基因检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液体系包括T4缓冲液和Phi29缓冲液。5.利用权利要求1
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4任一项所述的Pax
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5a基因检测试剂盒非疾病诊断为目的的检测Pax
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5a基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将A1链溶液、A2链溶液和A3链溶液混合，37 ℃孵育90min得三链复合结构的M溶液；（2）将Pad
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lock溶液、T4缓冲液、T4 DNA连接酶和待测溶液混匀后加入无菌水，在37 ℃反应2小时得预反应液；（3）向步骤（2）的预反应液中加入Phi29缓冲液、Phi29聚合酶、dNTPs和灭菌水，混匀后在37 ℃反应2小时，再加热使酶失活，得反应液；（4）向步骤（3）的反应液中加入M溶液和AP链溶液，即得待测反应液；（5）步骤（4）的待测反应液经荧光测定，记录激发波长为492nm时的荧光信号变化值F，代入线性方程获得待测溶液中Pax
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5a基因的浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪嘉仪，章鑫怡，黎泓波，王素琴，
申请(专利权)人：江西师范大学，
类型：发明
国别省市：