基于核磁代谢组学研究维生素K1促凝血作用机制的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于核磁代谢组学研究维生素K1促凝血作用机制的方法，包括：以华法林对大鼠进行灌胃给药造成大鼠出血模型后，给予维生素K1注射液尾静脉注射治疗，运用1HNMR对大鼠血清进行分析，得到代谢物核磁氢谱信息，通过建立正交偏最小二乘法判别分析模型对代谢物的核磁氢谱信息进行筛选，得到潜在生物标志物；对潜在的生物标志物进行代谢通路富集分析，得到相关重要代谢通路；将重要的代谢通路里的潜在生物标志物通过代谢通路连接起来，得到综合代谢网络。本发明专利技术的方法从整体水平，更加全面、无偏向性地解释维生素K1发挥促凝血作用的作用机制，为维生素K1促凝血作用机制的后续研究提供新的思路。后续研究提供新的思路。后续研究提供新的思路。

【技术实现步骤摘要】
基于核磁代谢组学研究维生素K1促凝血作用机制的方法


[0001]本专利技术涉及生物分析
，更具体地说，本专利技术涉及一种基于核磁代谢组学研究维生素K1促凝血作用机制的方法。

技术介绍

[0002]维生素K1是一种含甲萘醌结构脂溶性的维生素，属于维生素K系列化合物，是维持人体健康必不可少的营养素，影响着人体生理机能的正常运转，凝血功能是其主要的生理功能，维生素K1是合成活性凝血因子II、VII、IX、X重要辅因子。维生素K在细胞内被一种位于内质网膜中的维生素K环氧化物酶(VKOR)还原为其生物活性氢醌形式(VitaminKH2)，VKH2作为γ
‑
谷氨酰羧基酶(GGCX)的辅因子，将维生素K依赖凝血因子的谷氨酸(Glu)羧化为γ
‑
羧基谷氨酸(Gla)，同时VitaminKH2转化为维生素K 2,3
‑
环氧化物，随后，VKOR将维生素K环氧化物还原为维生素K，以此完成催化循环，这是目前公认的维生素K在体内合成维生素K依赖凝血因子所经历的循环过程和发挥凝血作用的机制假说。香豆素类华法林抗凝药可以通过阻断维生素K环氧化物酶(VKOR)的活性，造成维生素K依赖凝血因子合成障碍来发挥抗凝作用，但是高浓度维生素K可以逆转华法林的抗凝效果，其具体的作用机制尚不清楚。
[0003]代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后迅速起来的对某一生物或细胞中所有低相对分子质量(分子量小于1000Da)的内源性代谢产物进行定性、定量分析的新兴组学技术，它可以提供一个全面而无偏向性的生物代谢谱。代谢组学强调将研究对象视为一个整体进行研究，通过测定生物体受到刺激或扰动后其机体内源性代谢产物的变化或其随时间的变化来研究该生物体代谢网络或者药物的作用机制。朱洁等运用代谢组学的方法探究色胺酮抗小鼠溃疡性结肠炎的作用机制，发现色胺酮可能是通过影响嘌呤代谢、花生四烯酸代谢和色氨酸代谢发挥抗溃疡性结肠的作用。运用代谢组学技术研究药物
‑
疾病之间的关系，通过机体的代谢通路变化，可以从整体系统性的阐明药物与疾病之间的关系，对药物的作用机制进行补充说明。
[0004]其中液质联用(LC
‑
MS)、气质联用(GC
‑
MS)和核磁共振波谱(NMR)系应用于代谢组学研究的三大主要分析技术。基于1H
‑
NMR的代谢组学具有无偏倚、处理简单等优点，1H
‑
NMR代谢组学的研究方法已经成为研究机体代谢变化与药物、疾病相关联的强有力的工具。
[0005]因此，有必要设计一种基于1H
‑
NMR代谢组学建立维生素K1发挥凝血作用的研究方法，从整体水平，更加全面、无偏向性地解释维生素K1发挥促凝血作用的作用机制，为维生素K1促凝血作用机制的后续研究提供新的思路。

技术实现思路

[0006]针对上述的问题，本专利技术的目的是提供一种基于核磁代谢组学研究维生素K1促凝血作用机制的方法，从整体水平，更加全面、无偏向性地解释维生素K1发挥促凝血作用的作用机制，为维生素K1促凝血作用机制的后续研究提供新的思路。
[0007]为了实现本专利技术的这些目的，本专利技术提供的基于核磁代谢组学研究维生素K1促凝血作用机制的方法，包括：
[0008]以华法林对大鼠给药造成出血模型，以维生素K1进行治疗，设立对照组，收集大鼠血清进行氢谱核磁共振，得到代谢物的核磁氢谱信息；
[0009]通过建立正交偏最小二乘法判别分析模型对代谢物的核磁氢谱信息进行筛选，得到潜在生物标志物；其中的筛选条件为变量重要性投影值大于1、p值小于0.05；
[0010]对潜在生物标志物进行代谢通路富集，得到维生素K1发挥凝血作用的相关代谢通路；
[0011]将重要的代谢通路里的潜在生物标志物通过代谢通路连接起来，得到综合代谢网络。
[0012]上述方案中，首先通过核磁共振波普技术对不同组别的血清代谢物进行分析，得到包含代谢物信息核磁氢谱；据在软件Chenomx NMR suit 8.6Evaluate模式下中标准化合物的化学位移和the Human Metabolome Database(HUMDB)、Biological Magnetic Resonance Date Bank(BMRB)网站中的数据库以及文献中数据对图谱指认；建立正交偏最小二乘法判别分析模型根据变量重要性投影值大于1、p值小于0.05的条件筛选数据，得到潜在生物标志物；将潜在生物标志物的积分值以“txt”文件格式导出使用spss进行独立样本t检验，以α＝0.05为检验水准，得到具有统计学差异的代谢物；根据这些具有差异的代谢物进行代谢通路富集，得到华法林造成大鼠出血和维生素K1治疗后大鼠代谢紊乱发生发展的相关重要代谢通路；将重要的代谢通路连接起来，得到综合代谢网络。
[0013]优选的是，所述大鼠血清通过以下方式获得：
[0014]根据大鼠重量对动物随机分为空白组、模型组、维生素K1治疗组。模型组与维生素K1治疗组给予华法林钠溶液灌胃，按5mg
·
kg
‑1剂量标准给药，每天于固定时间灌胃1次，连续给药3d，空白组给予等量生理盐水，大鼠出血模型成功后，最后一次华法林造模后禁食不禁水，维生素K1治疗组给予360ug
·
100g
‑1、空白组与模型组给予等剂量的生理盐水，6h后采集得到。
[0015]优选的是，血清样本预处理方法为：
[0016]于血清加入两倍体积量的甲醇涡旋混合，静置20min，4℃下13000rpm离心15min，取上清液，将上清液氮气吹干，核磁测定之前，加入500μL PBS缓冲液复溶，4℃下，12000rpm离心10min后，取上清液450μL于新的离心管中，加入50μL D2O，其中含2mg/mL的TSP，涡旋30s混合，置于5mm核磁管中直至分析。
[0017]优选的是，上述核磁波谱分析的条件为：
[0018]质子频率为600.15MHz，温度为295.7K，采用Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy(NOESY，RD
‑
90
°‑
t1
‑
90
°‑
tm
‑
90
°‑
acquire)序列，扫描次数32次，谱宽12500.0Hz，脉冲宽度10.97us。
[0019]优选的是，在多元统计主成分分析之前，在MestReNova 6.1软件中对核磁图谱以TSP化学位移为0ppm进行定标，调整基线与相位，对化学位移0.5ppm
‑
9.0m的图谱以0.001ppm等宽度分割，切除水峰区域4.5ppm
‑
5.6ppm区域与甲醇3.34ppm
‑
3.38ppm，对峰面积进行归一化处理。
[0020]优选的是，获得所述潜在差异代谢物的具体步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于核磁代谢组学研究维生素K1促凝血作用机制的方法，其特征在于，包括：以华法林对大鼠进行灌胃给药造成大鼠出血模型后，给予维生素K1注射液尾静脉注射治疗，运用1HNMR对大鼠血清进行分析，得到代谢物核磁氢谱信息；通过建立正交偏最小二乘法判别分析模型对代谢物的核磁氢谱信息进行筛选，得到潜在生物标志物；其中筛选条件为变量重要性投影值大于1、P值小于0.05；对潜在的生物标志物进行代谢通路富集分析，得到华法林造成大鼠出血和维生素K1注射液治疗后引起体内代谢物变化发生发展的相关重要代谢通路；将重要的代谢通路里的潜在生物标志物通过代谢通路连接起来，得到综合代谢网络。2.如权利要求1所述的基于核磁代谢组学研究维生素K1促凝血作用机制的方法，其特征在于，所述华法林造成大鼠出血模型通过以下方式获得：大鼠选用雄性SD大鼠，适应性喂养，根据大鼠重量对动物随机分为空白组、模型组、维生素K1治疗组；模型组与维生素K1治疗组给予华法林钠溶液灌胃，按5mg
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kg
‑1剂量标准给药，每天于固定时间灌胃1次，空白组给予等量生理盐水，连续给药3d，最后一次华法林造模后禁食不禁水，4h后维生素K1治疗组尾静脉注射维生素K1注射液36ug
·
kg
‑1，空白组与模型组给予等剂量的生理盐水，采集血清。3.如权利要求1所述的基于核磁代谢组学研究维生素K1促凝血作用机制的方法，其特征在于，所述血清样本处理的条件为：于血清中加入两倍体积量的甲醇混合，静置，4℃下离心，取上清液，N2吹干，加入PBS缓冲液复溶，离心后，取上清液，加入D2O，其中含2mg/mL的TSP，混合，进行核磁共振测定。4.如权利要求1所述的基于核磁代谢组学研究维生素K1促凝血作用机制的方法，其特征在于，所述核磁共振波普分析的条件为：质子频率为600.15MHz，温度为295.7K，采用Nuclear Overhauser Effec...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞萍，李玉娜，李琼香，范乐之，凌梅鲜，
申请(专利权)人：广西铭磊维生制药有限公司，
类型：发明
国别省市：