通用供体细胞制造技术

本文提供了与多于一名受试者相容的遗传修饰的细胞，例如通用供体细胞，以及产生所述遗传修饰的细胞的方法。通用供体细胞在编码一种或更多种MHC

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通用供体细胞
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年12月31日提交的美国临时申请第63/132,890号、2021年8月19日提交的美国临时申请第63/234,997号和2021年12月10日提交的美国临时申请第63/288,356号的权益，每个申请的公开内容通过引用以其全文并入本文。
[0003]通过引用并入序列表
[0004]本申请包含经由EFS
‑
Web以ASCII格式提交的序列表，并通过引用将其全文特此并入。于2021年12月22日生成的ASCII副本被命名为CT154_Sequence_Listing_ST25.txt并且大小为约131,000字节。
专利

[0005]本专利技术涉及基因编辑领域，并且在一些实施方案中，涉及出于产生与多于一个受试者相容的细胞(例如，通用供体细胞)的目的的遗传修饰。
[0006]背景
[0007]已经提出了多种方法来克服移植或植入细胞的同种异体排斥，包括HLA匹配、用抗体阻断触发T细胞活化的途径、使用免疫抑制药物混合物(cocktail)和自体细胞治疗。另一种抑制移植排斥的策略包括使移植或植入细胞和受体之间的同种异体差异最小化。细胞表面表达的人类白细胞抗原(HLA)是由位于6号染色体上的人类主要组织相容性复合体中的基因编码的分子，是免疫排斥的主要介体。供体和受试者之间单个HLA基因的错配会引起稳健的免疫应答(Fleischhauer K.等人.“Bone marrow
‑
allograft rejection by T lymphocytes recognizing a single amino acid difference in HLA
‑
B44,”N Engl J Med.,1990,323:1818
‑
1822)。HLA基因分为MHC I类(MHC
‑
I)和MHC II类(MHC
‑
II)。MHC
‑
I基因(HLA
‑
A、HLA
‑
B和HLA
‑
C)在几乎所有组织细胞类型中表达，向CD8+T细胞呈递“非自身”抗原加工肽，从而促进其活化为溶细胞性CD8+T细胞。表达“非自身”MHC
‑
I分子的移植或植入细胞将引起针对这些细胞的稳健的细胞免疫应答，并最终通过活化的溶细胞性CD8+T细胞导致这些细胞的死亡。MHC
‑
I蛋白与内质网中的β
‑2‑
微球蛋白(B2M)密切相关，β
‑2‑
微球蛋白是在细胞表面形成功能性MHC
‑
I分子所必需的。
[0008]与MHC
‑
I基因的广泛细胞表达不同，MHC
‑
II基因的表达仅限于抗原呈递细胞，诸如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。HLA抗原基因是在人类基因组中观察到的多态性最丰富的基因(the most polymorphic genes)(Rubinstein P.,“HLA matching for bone marrow transplantation
‑‑
how much is enough？”N Engl J Med.,2001,345:1842
‑
1844)。与任何HLA基因型相容的“通用供体”细胞的产生提供了一种替代策略，可以解决免疫排斥和当前免疫逃避方法的相关经济成本。
[0009]为了产生这样的通用供体细胞系，以前的一种方法是功能性地破坏MHC
‑
I和MHC
‑
II类基因的表达。这可以通过遗传破坏例如编码MHC
‑
I轻链B2M的两个遗传等位基因来实现。由此产生的B2M无效细胞系(B2M
‑
null cell line)及其派生物(derivatives)有望展示极大降低的表面MHC
‑
I，从而降低对同种异体CD8+T细胞的免疫原性。靶向转录激活因子样
效应物核酸酶(TALEN)的方法已被用于通过缺失B2M基因外显子2中的若干核苷酸来产生B2M缺陷型hESC系(Lu,P.等人,“Generating hypoimmunogenic human embryonic stem cells by the disruption of beta 2
‑
microglobulin,”Stem Cell Rev.2013,9:806
‑
813)。尽管靶向B2M的hESC系表现为表面HLA
‑
I缺陷型的，但发现它们仍然含有B2M和MHC
‑
I的特定mRNA。B2M和MHC
‑
I mRNA以相当于非靶向hESC的水平(组成型和IFN
‑
g诱导的)表达。因此，担心这些靶向TALEN B2M的hESC系可能表达足以引起免疫排斥的残留的细胞表面MHC
‑
I，如用仍表达B2M mRNA的B2M2/2小鼠细胞观察到的那样(Gross,R.和Rappuoli,R.“Pertussis toxin promoter sequences involved in modulation,”Proc Natl Acad Sci,1993,90:3913
‑
3917)。尽管没有检查靶向TALEN B2M的hESC系的脱靶裂解事件，但是当使用TALEN时，非特异性裂解的发生仍然是一个重要的问题，这将产生关于其临床使用的主要的安全性问题(Grau,J.等人.“TALENoffer:genome
‑
wide TALEN off
‑
target prediction,”Bioinformatics,2013,29:2931
‑
2932；Guilinger J.P.等人.“Broad specificity profiling of TALENs results in engineered nucleases with improved DNA
‑
cleavage specificity,”Nat Methods 2014,11:429
‑
435)。此外，另一份报告通过敲除第一个B2M等位基因并在第二个B2M等位基因处敲入HLA
‑
E基因，这导致HLA
‑
E二聚体或三聚体的表面表达，而不存在HLA
‑
A、HLA
‑
B或HLA
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C的表面表达，产生了逃脱同种异体识别的IPS细胞(Gornalusse,G.G.等人,“HLA
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E
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expressing pluripotent stem cells escape allogeneic responses an本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于产生通用供体细胞的体外方法，所述方法包括向干细胞递送：(a)RNA引导的核酸酶和靶向第一靶基因座中的靶位点的引导RNA(gRNA)以及包含编码肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)、中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)、分化簇39(CD39)和/或分化簇73(CD73)的核苷酸序列的第一核酸，其中所述第一靶基因座在所述靶位点处被裂解并且所述第一核酸被插入所述靶基因座，从而破坏靶基因；和/或(b)RNA引导的核酸酶和靶向β
‑
2微球蛋白(B2M)基因座中的靶位点的引导RNA(gRNA)，其中所述B2M基因座在所述靶位点处被裂解，从而破坏B2M基因；和/或(c)RNA引导的核酸酶和靶向硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)基因座中的靶位点的引导RNA(gRNA)，其中所述TXNIP基因座在所述靶位点处被裂解，从而破坏TXNIP基因；和/或(d)RNA引导的核酸酶和靶向II类反式激活因子(CIITA)基因座中的靶位点的引导RNA(gRNA)，其中所述CIITA基因座在所述靶位点处被裂解，从而破坏CIITA基因；和/或(e)RNA引导的核酸酶和靶向转化生长因子β(TGFβ)基因座中的靶位点的引导RNA(gRNA)，其中所述TGFβ基因座在所述靶位点处被裂解，从而破坏TGFβ基因。2.根据权利要求1所述的体外方法，其中(a)的所述靶基因座选自(b)的B2M基因座或β
‑
2微球蛋白(B2M)基因座、(c)的TXNIP基因座或硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)基因座、(d)的CIITA基因座或II类反式激活因子(CIITA)基因座和(e)的TGFβ基因座或转化生长因子β(TGFβ)基因座，其中所述通用供体细胞具有B2M、TXNIP、CIITA和/或TGFβ的被破坏的表达。3.根据权利要求1或2所述的体外方法，其中B2M、TXNIP、CIITA和/或TGFβ的所述被破坏的表达包括B2M、TXNIP、CIITA和/或TGFβ的表达减少或消除。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的体外方法，其中(a)的所述靶基因座是所述B2M基因座，并且所述核酸还包含(i)与位于所述B2M基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(ii)与位于所述B2M基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39和/或CD73的所述核苷酸序列的侧翼为(i)和(ii)；和/或(a)的所述靶基因座是(b)的所述B2M基因座，并且所述第一核酸还包含(iii)与位于(b)的所述B2M基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(iv)与位于(b)的所述B2M基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39和/或CD73的所述核苷酸序列的侧翼为(iii)和(iv)；并且其中所述通用供体细胞具有B2M的被破坏的表达。5.根据权利要求4所述的体外方法，其中(i)或(iii)的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:15或基本上由SEQ ID NO:15组成。6.根据权利要求4或5所述的体外方法，其中(ii)或(iv)的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:22或基本上由SEQ ID NO:22组成。7.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的体外方法，其中(a)的所述靶基因座是所述TXNIP基因座，并且所述核酸还包含(i)与位于所述TXNIP基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(ii)与位于所述TXNIP基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39和/或CD73的所述核苷酸序列的侧翼为(i)和(ii)；和/或(a)的所述靶基因座是(c)的所述TXNIP基因座，并且所述第一核酸还包含(iii)与位于(c)的所述TXNIP基因座中的所述靶位点左侧的基因组区
域具有序列同源性的核苷酸序列；和(iv)与位于(c)的所述TXNIP基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39和/或CD73的所述核苷酸序列的侧翼为(iii)和(iv)；并且其中所述通用供体细胞具有TXNIP的被破坏的表达。8.根据权利要求7所述的体外方法，其中(i)或(iii)的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:42或基本上由SEQ ID NO:42组成。9.根据权利要求7或8所述的体外方法，其中(ii)或(iv)的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:44或基本上由SEQ ID NO:44组成。10.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的体外方法，其中(a)的所述靶基因座是所述CIITA基因座，并且所述核酸还包含(i)与位于所述CIITA基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(ii)与位于所述CIITA基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39和/或CD73的所述核苷酸序列的侧翼为(i)和(ii)；和/或(a)的所述靶基因座是(d)的所述CIITA基因座，并且所述核酸还包含(iii)与位于(d)的所述CIITA基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(iv)与位于(d)的所述CIITA基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39和/或CD73的核苷酸序列的侧翼为(iii)和(iv)；并且其中所述通用供体细胞具有CIITA的被破坏的表达。11.根据权利要求10所述的体外方法，其中(i)或(iii)的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:26或基本上由SEQ ID NO:26组成。12.根据权利要求10或11所述的体外方法，其中(ii)或(iv)的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:28或基本上由SEQ ID NO:28组成。13.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的体外方法，其中(a)的所述靶基因座是所述TGFβ基因座，并且所述核酸还包含(i)与位于所述TGFβ基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(ii)与位于所述TGFβ基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39和/或CD73的所述核苷酸序列的侧翼为(i)和(ii)；和/或(a)的所述靶基因座是(e)的所述TGFβ基因座，并且所述核酸还包含(iii)与位于(e)的所述TGFβ基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(iv)与位于(e)的所述TGFβ基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39和/或CD73的所述核苷酸序列的侧翼为(iii)和(iv)；并且其中所述通用供体细胞具有TGFβ的被破坏的表达。14.根据权利要求1至13中任一项所述的体外方法，其中(b)的所述靶位点包含基本上由SEQ ID NO:1至13中任一项组成的核苷酸序列。15.根据权利要求1至14中任一项所述的体外方法，其中(c)的所述靶位点包含基本上由SEQ ID NO:32
‑
41中任一项组成的核苷酸序列。16.根据权利要求1至15中任一项所述的体外方法，其中(d)的所述靶位点包含基本上由SEQ ID NO:25和48
‑
51中任一项组成的核苷酸序列。17.根据权利要求1至16中任一项所述的体外方法，其中(e)的所述靶位点包含基本上由SEQ ID NO:57组成的核苷酸序列。18.根据权利要求1至17中任一项所述的体外方法，还包括向所述干细胞递送：
(f)RNA引导的核酸酶和靶向靶基因座中的靶位点的引导RNA(gRNA)，以及包含编码肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)、中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)、分化簇39(CD39)、分化簇73(CD73)、HLA I类组织相容性抗原α链E(HLA
‑
E)和/或程序性死亡配体1(PD
‑
L1)的核苷酸序列的核酸，其中所述靶基因座在所述靶位点处被裂解，并且包含编码TNFAIP3、MANF、CD39、CD73、HLA
‑
E和/或PD
‑
L1的核苷酸序列的所述核酸被插入所述靶基因座，从而破坏靶基因。19.根据权利要求18所述的体外方法，其中(f)的所述靶基因座选自(b)的β
‑
2微球蛋白(B2M)基因座或B2M基因座、(c)的硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)基因座或TXNIP基因座、(d)的II类反式激活因子(CIITA)基因座或CIITA基因座和/或(e)的转化生长因子β(TGFβ)基因座或TGFβ基因座，并且其中所述通用供体细胞具有B2M、TXNIP、CIITA和/或TGFβ的被破坏的表达。20.根据权利要求18或19所述的体外方法，其中(f)的所述靶基因座是所述B2M基因座，并且(f)的所述核酸还包含(i)与位于所述B2M基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(ii)与位于所述B2M基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39、CD73、HLA
‑
E和/或PD
‑
L1的所述核苷酸序列的侧翼为(i)和(ii)；和/或(f)的所述靶基因座是(b)的所述B2M基因座，并且所述核酸还包含(iii)与位于(b)的所述B2M基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(iv)与位于(b)的所述B2M基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39、CD73、HLA
‑
E和/或PD
‑
L1的所述核苷酸序列的侧翼为(iii)和(iv)；并且其中所述通用供体细胞具有B2M的被破坏的表达。21.根据权利要求20所述的体外方法，其中(i)或(iii)的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:15或基本上由SEQ ID NO:15组成。22.根据权利要求20或21所述的体外方法，其中(ii)或(iv)的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:22或基本上由SEQ ID NO:22组成。23.根据权利要求19所述的体外方法，其中(f)的所述靶基因座是所述TXNIP基因座，并且(f)的所述核酸还包含(i)与位于所述TXNIP基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(ii)与位于所述TXNIP基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39、CD73、HLA
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E和/或PD
‑
L1的所述核苷酸序列的侧翼为(i)和(ii)；和/或(f)的所述靶基因座是(c)的所述TXNIP基因座，并且所述核酸还包含(iii)与位于(c)的所述TXNIP基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(iv)与位于(c)的所述TXNIP基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39、CD73、HLA
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E和/或PD
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L1的所述核苷酸序列的侧翼为(iii)和(iv)；并且其中所述通用供体细胞具有TXNIP的被破坏的表达。24.根据权利要求23所述的体外方法，其中(i)或(iii)的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:42或基本上由SEQ ID NO:42组成。25.根据权利要求23或24所述的体外方法，其中(ii)或(iv)的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:44或基本上由SEQ ID NO:44组成。
26.根据权利要求18或19所述的体外方法，其中(f)的所述靶基因座是所述CIITA基因座，并且(f)的所述核酸还包含(i)与位于所述CIITA基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(ii)与位于所述CIITA基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39、CD73、HLA
‑
E和/或PD
‑
L1的所述核苷酸序列的侧翼为(i)和(ii)；和/或(f)的所述靶基因座是(d)的所述CIITA基因座，并且所述核酸还包含(iii)与位于(d)的所述CIITA基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(iv)与位于(d)的所述CIITA基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39、CD73、HLA
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E和/或PD
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L1的所述核苷酸序列的侧翼为(iii)和(iv)；并且其中所述通用供体细胞具有CIITA的被破坏的表达。27.根据权利要求26所述的体外方法，其中(i)或(iii)的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:26或基本上由SEQ ID NO:26组成。28.根据权利要求26或27所述的体外方法，其中(ii)或(iv)的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:28或基本上由SEQ ID NO:28组成。29.根据权利要求19所述的体外方法，其中(f)的所述靶基因座是所述TGFβ基因座，并且(f)的所述核酸还包含(i)与位于所述TGFβ基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(ii)与位于所述TGFβ基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39、CD73、HLA
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E和/或PD
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L1的所述核苷酸序列的侧翼为(i)和(ii)；和/或(f)的所述靶基因座是(e)的所述TGFβ基因座，并且所述核酸还包含(iii)与位于(e)的所述TGFβ基因座中的所述靶位点左侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列；和(iv)与位于(e)的所述TGFβ基因座中的所述靶位点右侧的基因组区域具有序列同源性的核苷酸序列，其中编码TNFAIP3、MANF、CD39、CD73、HLA
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E和/或PD
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L1的所述核苷酸序列的侧翼为(iii)和(iv)；并且其中所述通用供体细胞具有TGFβ的被破坏的表达。30.根据权利要求18至29中任一项所述的体外方法，其中(f)的所述靶基因座与(a)的所述靶基因座相同。31.根据权利要求18至29中任一项所述的体外方法，其中(f)的所述靶基因座不同于(a)的所述靶基因座。32.根据权利要求18至31中任一项所述的体外方法，还包括向所述干细胞递送：(g)RNA引导的核酸酶和靶向靶基因座中的靶位点的引导RNA(gRNA)，以及包含编码肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)、中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)、分化簇39(CD39)、分化簇73(CD73)、HLA
‑
E和/或PD
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L1的核苷酸序列的核酸，其中所述靶基因座在所述靶位点处被裂解，并且包含编码TNFAIP3、M...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：克里斯珀医疗股份公司，
类型：发明
国别省市：