包含N制造技术

本发明专利技术涉及采用具有Asn特异性环化酶活性的酶从包含连接基序的(多)肽生成环化(多)肽的方法，所述连接基序包含N

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含N
γ
‑
羟基
‑
或N
γ
‑
氨基
‑
L
‑
天冬酰胺的多肽环化方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2021年3月5日提交的新加坡专利申请No.10202102295S的优先权，出于所有目的，其内容通过引用整体并入本文。


[0003]本专利技术属于酶促(多)肽连接
，具体涉及使用具有Asn特异性环化酶活性的酶的方法，作为从包含连接基序的(多)肽生成环化(多)肽的手段，其中所述连接基序包含N
γ
‑
羟基
‑
L
‑
天冬酰胺或N
γ
‑
氨基
‑
L
‑
天冬酰胺残基。本文还包括所得的环化(多)肽和相应的用途。

技术介绍

[0004]大环化是限制线性肽构象的有效方法，可以提高其代谢稳定性和药理活性(Vinogradov etal.ChemMedChem,2013,8,377
–
384)。环肽的表面积大，具有很高的结合亲和力和选择性，可抑制蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而小分子化合物通常是“无法抑制”这种相互作用的(Lau&Dunn,Bioorg.Med.Chem.,2018,26,2700
–
2707；Fosgerau&Hoffmann,Drug Discovery Today,2015,20,122
‑
128)。最近，研究表明天冬酰胺酰内肽酶(AEP)是植物中环肽大环化的生物催化剂(Saska et al.J.Biol.Chem.,2007,282,29721
–
29728；S.Harris et al.Nat.Commun.,2015,6,10199；Nguyen et al.Nat.Chem.Biol.,2014,10,732
‑
738)。AEP是半胱氨酸内肽酶，通常能识别并水解Asn或Asp残基后的肽键(Abe et al.J.Biol.Chem.,1993,268,3525
‑
3529；Wang&Hugh,Nat.Struct.Mol.Biol.,1994,1,502
‑
504)。有趣的是，AEP家族的一些成员通过转肽作用催化新天冬酰胺酰肽键的形成，因此被称为肽基天冬酰胺酰连接酶(PAL)(Nguyen et al.Nat.Chem.Biol.,2014,10,732
‑
738；Harris et al.Sci.Rep.,2019,9,10820；Hemu et al.Proc.Natl.Acad.Sci.,2019,116,11737
‑
1174；Hemu et al.ACS Catal.2020,10,8825
‑
8834；Tam et al.Sci.China Chem.2020,3,296
‑
307)。尽管PAL被归类为Asx特异性酶，但它们中的大多数对P1
‑
Asn底物比对P1
‑
Asp底物具有更强烈的偏好，两种类型的底物的环化反应速率通常相差100至800倍(Nguyen et al.,supra；Bernath
‑
Levn et al.Chemistry&Biology,2015,22,571
‑
582)。因此，迄今为止报道的几乎所有PAL介导的连接/环化的应用都仅限于P1
‑
Asn底物(Harris et al.Sci.Rep.,2019,9,10820；Hemu et al.J.Am.Chem.Soc.,2016,138,6968
‑
6971；Rehm et al.J.Am.Chem.Soc.,2019,141,17388
‑
17393；Nguyen et al.Angew.Chem.Int.Ed.,2016,55,12802；Cao et al.Chem.Commun.,2015,51,17289
‑
17292；Bi et al.Angew.Chem.Int.Ed.,2017,56,7822
–
7825)。如果能够拓宽PAL(例如butelasel、VyPAL2和OaAEPbl等)的底物范围，它们的应用范围就能大大拓展。AEP可在酸性pH条件下裂解天冬氨酰肽键，并在接近中性pH条件下进行转肽反应。AEP
‑
天冬氨酰肽抑制剂复合物的结构特性分析表明，P1
‑
Asp的侧链羧基γ
‑
COOH作为氢键供体，与酶S1口袋中的关键残基形成氢键(Zauner et al.J.Biol.Chem.,2018,293,8934
–
8946；James et al.PlantJ,2019,98,988
‑
999)。由于羧酸基团的pKa较低，因此需要较低的pH(最佳pH 4
‑
5)才能使其保持质子化形式以便与酶结合。然而，在此pH值下，任何引入的肽的胺亲核试剂大部分都被质子化，使其在连接反应中不太可能攻击酰基酶硫酯中间体。这种困境是PAL催化的天冬氨酰键连接比天冬酰胺酰键连接慢得多的主要原因。
[0005]因此，本领域需要一种策略，可以利用PAL的酶活性，通过Asp残基对(多)肽进行环化。

技术实现思路

[0006]本专利技术人令人惊讶地发现N
γ
‑
羟基
‑
L
‑
天冬酰胺(本文也称为“Asn(OH)”或“N(OH)”；同义词：β
‑
L
‑
天冬氨酰异羟肟酸；L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
异羟肟酸)，它被设计为Asn的模拟物，其侧链酰胺被N
‑
羟基修饰，能够通过其侧链γ
‑
CO
‑
NH(OH)与酶的S1口袋形成与Asn类似的相互作用。特别是，N
‑
OH基团较高的pKa值有助于在中性至弱碱性pH下保持其作为氢键供体的作用。结果表明，在环化反应中，P1
‑
Asn(OH)肽能够被PAL(例如butelase
‑
1和VyPAL2)很好地识别(表1和图5、图6)。这种非天然的Asn(OH)残基随后可以作为金属离子的螯合剂来抑制金属酶，或者可以在温和的氧化反应中转化为Asn(图1)。N
γ
‑
氨基
‑
L
‑
天冬酰胺(本文也称为N
‑
γ
‑
氨基
‑
L
‑
天冬酰胺、“Asn(NH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种使包含N
γ
‑
羟基
‑
L
‑
天冬酰胺(N(OH))或N
γ
‑
氨基
‑
L
‑
天冬酰胺(N(NH2))残基的(多)肽环化的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供包含N
γ
‑
羟基
‑
L
‑
天冬酰胺或N
γ
‑
氨基
‑
L
‑
天冬酰胺残基的线性(多)肽；(ii)使所述包含N
γ
‑
羟基
‑
L
‑
天冬酰胺或N
γ
‑
氨基
‑
L
‑
天冬酰胺残基的线性(多)肽与肽基天冬酰胺酰连接酶(PAL)接触，在允许N
γ
‑
羟基
‑
L
‑
天冬酰胺或N
γ
‑
氨基
‑
L
‑
天冬酰胺残基的氨基酸C端裂解并且N
γ
‑
羟基
‑
L
‑
天冬酰胺或N
γ
‑
氨基
‑
L
‑
天冬酰胺残基的C端与(多)肽的N端连接的条件下，使(多)肽环化。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含N
γ
‑
羟基
‑
L
‑
天冬酰胺或N
γ
‑
氨基
‑
L
‑
天冬酰胺残基的线性(多)肽包含或由氨基酸序列(X)
o
N(OH)(X)
p
或(X)
o
N(NH2)(X)
p
组成，其中X是任何氨基酸，o是1或更大、优选2或更大的整数，p是1或更大、优选2或更大的整数并且更优选2，N(OH)为N
γ
‑
羟基
‑
L
‑
天冬酰胺且N(NH2)为N
γ
‑
氨基
‑
L
‑
天冬酰胺。3.根据权利要求2所述的方法，其中(X)
p
是X3X4(X)
r
，其中X3是除P之外的任何氨基酸，优选A、C、F、G、H、K、N、Q、R、S、Y、I，优选H、G、S、N、Q和R，更优选H、G或S，X4是疏水性或芳香族氨基酸，优选选自L、I、V、F、C、W、Y和M，优选V、L、I和F，且r为0或1或更大的整数，优选0。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述(多)肽包含氨基酸序列N(OH)HV或N(OH)GL或N(OH)SL或N(OH)AL或N(OH)IV或N(NH2)HV或N(NH2)GL或N(NH2)SL或N(NH2)AL或N(NH2)IV，优选在其C端。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述(多)肽包含N端氨基酸序列X1X2，其中X1为G或H，且X2为G、F、L、V或I。6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述PAL选自butelase
‑
1、VyPAL2和OaAEP1b或其变体。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述PAL是VyPAL2或其变体并且所述(多)肽包含氨基酸序列(X)
o
N(OH)X3X4(X)
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘传法，夏轶尹，詹姆斯，
申请(专利权)人：南洋理工大学，
类型：发明
国别省市：