一种核酸合成用活化剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种核酸合成用活化剂及其制备方法，属于核酸合成技术领域，所述活化剂通过氨基四氮唑类化合物和羧基荧光素发生缩合反应制得，所述氨基四氮唑类化合物为1

【技术实现步骤摘要】
一种核酸合成用活化剂及其制备方法


[0001]本专利技术属于核酸合成
，具体涉及一种核酸合成用活化剂及其制备方法。

技术介绍

[0002]寡核苷酸合成主要以固相亚林酰胺法，自1987年被Marvin H.Caruthers专利技术之后，因其具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点，被广泛应用于分子生物学及医药研究等领域，目前已成为一项较为成熟的寡核苷酸合成方法。不同于酶促反应从5'端
→
3'端方向延伸的合成过程，固相亚磷酰胺法合成是由3'端开始。在合成过程中除合成柱、核苷单体外，还需要用到合成辅助试剂：如脱保护剂、活化剂、加帽剂等等。偶联反应发生之前，需先将下一个亚磷酰胺单体与四氮唑(催化剂)混合后置入合成柱，四氮唑的作用是将3'端磷酸基团位置上的二异丙胺基质子化，也称为活化。随后，脱保护反应中产生的活性基团(
‑
OH)会与活化后的四唑中间体结合，形成新的磷氧键，并脱去四唑，该步骤中会使用到核酸合成用活化剂。传统的活化剂主要以四氮唑为主，其作用是与核酸的亚磷酰胺单体发生反应生成活性中间体。然而该反应阶段极易发生未参与上一阶段循环的活性基团(
‑
OH)在新的循环中与新加入的亚磷酰胺单体发生偶联，产生短链杂质的现象，因此亟需开发一种可控调节偶联反应的活化剂。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种核酸合成用活化剂，该活化剂具有荧光效应，以解决的寡核苷酸合成偶联反应活化不可控的问题。
[0004]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0005]一种核酸合成用活化剂，通过质量比为5:1的氨基四氮唑类化合物和羧基荧光素缩合而成，具体制备方法为：将氨基四唑类化合物分散于溶剂中，加入羧基荧光素和N,N
’‑
二环己基碳二亚胺(DCC)，在室温(25
‑
30℃)下避光搅拌6
‑
8h，反应完成后，多次离心，洗涤脱去未反应的试剂，纯化后制得具有pH荧光响应的核酸合成用活化剂。
[0006]进一步的，所述氨基四氮唑类化合物为1
‑
甲基
‑5‑
氨基四氮唑、2
‑
甲基
‑5‑
氨基
‑
2H
‑
四氮唑中的一种。
[0007]进一步的，所述溶剂为N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)。
[0008]进一步的，所述羟基荧光素为5
‑
羧基荧光素(5
‑
FAM)、6
‑
羧基荧光素(6
‑
FAM)中的一种。
[0009]进一步的，所述DCC用量为羧基荧光素质量的2
‑
6倍。
[0010]本专利技术的有益效果：
[0011]1.本专利技术制备的核酸合成用活化剂可有效提高核酸合成效率，促进偶联反应的生成，具有良好的生物相容性。
[0012]2.本专利技术制备的核酸合成用活化剂具有荧光效应，当体系中上一阶段循环的未反应活性基团(
‑
OH)增多造成pH升高，此时荧光效应增强，直观表征活化阶段反应进程。
[0013]3.本专利技术制备的核酸合成用活化剂通过pH荧光响应，有效调控核酸合成中的偶联反应，减少短链杂质的产生。
附图说明
[0014]下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。
[0015]图1是本专利技术实施例3中荧光强度与活化剂用量关系图；
具体实施方式
[0016]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0017]实施例1
[0018]一种核酸合成用活化剂的制备：
[0019]称取0.5g1
‑
甲基
‑5‑
氨基四氮唑分散于40mLDMSO中，再加入0.1g5
‑
羧基荧光素和0.3gDCC，室温下避光搅拌7h，反应完成后，以8000rpm的转速离心，除去多余试剂，乙醇洗涤纯化后得到具有荧光效应的核酸合成用活化剂，结构为：
[0020][0021]实施例2
[0022]一种核酸合成用活化剂的制备：
[0023]称取0.5g2
‑
甲基
‑5‑
氨基
‑
2H
‑
四氮唑分散于40mLDMSO中，再加入0.1g6
‑
羧基荧光素和0.3gDCC，室温下避光搅拌7h，反应完成后，以8000rpm的转速离心，除去多余试剂，乙醇洗涤纯化后得到具有荧光效应的核酸合成用活化剂，结构为：
[0024][0025]实施例3
[0026]利用所制备的活化剂活化核酸合成过程中的偶联反应
[0027]用三氯乙酸(TCA)脱去连接在固相载体CPG上的核苷酸保护基团DMT(二甲氧基三苯基)，获得游离的5
’‑
羟基端，以供下一步偶联反应。
[0028]将100μmol亚磷酰胺保护的核苷酸单体与实施例1与实施例2所制备的活化剂分别
混合并进入合成柱，活化完成后，分离纯化利用荧光分光光度计进行荧光检测，获得荧光光强度与活化剂用量折线图如图1所示。
[0029]由图可知，实施例1与实施例2所合成的活化剂具有相当的效果。当活化剂用量少于200μL时，核酸合成过程中偶联反应不完全，体系中游离大量
‑
OH基团造成pH上升，此时荧光强度较大；随着活化剂用量的逐渐增多，活化效率进一步增大，此时体系中产生的游离
‑
OH减少，pH变化变小，此时荧光强度变化较小；当活化剂用量达到200μL时，此时活化效率最高，继续增大活化剂用量对活化效率无太大影响。因此本专利技术中的核酸合成用活化剂可以通过荧光强弱调控活化进程，减少核酸合成中短链杂质的产生。
[0030]需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0031]尽管已经示出和描述了本专利技术的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本专利技术的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本专利技术的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸合成用活化剂，其特征在于，所述活化剂通过质量比为5:1的氨基四氮唑类化合物和羧基荧光素缩合而成。2.根据权利要求1所述的一种核酸合成用活化剂，其特征在于，所述氨基四氮唑类化合物为1
‑
甲基
‑5‑
氨基四氮唑、2
‑
甲基
‑5‑
氨基
‑
2H
‑
四氮唑中的一种。3.根据权利要求1所述的一种核酸合成用活化剂，其特征在于，所述羧基荧光素为5
‑
羧基荧光素、6
‑
羧基荧光素中的一种。4.根据权利要求1所述的一种核酸合成用活化剂的制备方法，其特征在于，包括以下...

【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，刘宗文，刘奇，高恩，钱鑫，
申请(专利权)人：安徽瑞拜药业有限公司，
类型：发明
国别省市：