本发明专利技术涉及一种适于纤维化加工的蛋清溶菌酶的简易提取纯化方式。新鲜蛋清(pH＞8.0)在酸性条件下加热除去部分杂蛋白，在离心后的上清中分级加入固体硫酸铵粉末得到粗制溶菌酶沉淀，经透析除盐后，透析液与D152阳离子交换树脂按照一定的比例混合，于摇床中进行吸附。溶菌酶吸附于树脂中，经缓冲液洗涤和10％硫酸铵洗脱液洗脱，在收集的洗脱液中加入固体硫酸铵粉末沉淀溶菌酶，经透析、冻干即可得到溶菌酶。该方法制备的溶菌酶溶于超纯水后制成2wt％蛋白质溶液，在pH 2条件下高温(90℃)磁力搅拌孵育8h可制备得到蛋白质纤维。本发明专利技术联合热处理沉淀法和树脂共混离子交换法提取纯化溶菌酶，方法简单，设备要求少，易于扩大生产，且制备得到的溶菌酶可用于纤维化加工制备蛋白质纤维。蛋白质纤维。
【技术实现步骤摘要】
适于纤维化加工的蛋清溶菌酶的简易提取纯化方法
[0001]本专利技术涉及适于蛋清溶菌酶提取纯化的
，该方法提取的溶菌酶适于纤维化加工。
技术介绍
[0002]蛋清蛋白中含有约3.5％的溶菌酶，是提取溶菌酶的理想原料来源。纤维化加工是天然生物原料高值化加工利用的重要方式之一。蛋白质经过纤维化加工形成蛋白质纤维，从而能够成为众多高科技终端产品的构建原件。溶菌酶提取的传统工艺主要包括沉淀、超滤和离子交换色谱法。溶菌酶的等电点为11.35，而其他大多数蛋清蛋白的等电点在4.5
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6.1之间，且溶菌酶在酸性环境中具有良好的热稳定性，高温(100℃)短时加热仍可保持稳定，因此可以通过在酸性条件下加热除去杂蛋白，并经盐析富集粗制蛋白，但这种方法得到的溶菌酶纯度较低。与蛋清中其他蛋白质相比，溶菌酶的分子量要低得多，因此可以使用超滤技术进行提取纯化。但是，这种方法因为依赖特殊的设备以及高昂的成本而受到限制。离子交换色谱法通常可以获得纯度较高的溶菌酶，但传统柱色谱在使用中会出现多种问题，如长而致密的柱子压降大、传质慢、堵塞、持续时间长，短而宽的柱子则易出现填充不均匀的问题。直接树脂吸附离子交换法利用摇床振荡吸附，以避免上述柱色谱出现的问题。但是，该方法制备的溶菌酶在后续的酸热处理过程中出现了大量的沉淀，导致蛋白质纤维化的失败。本专利技术联合热处理沉淀法和树脂共混离子交换法，得到纯度为89％的溶菌酶；该溶菌酶经酸热处理的纤维化加工过程形成了蛋白质纤维，在偏振光下呈现出典型的双折射现象。虽然经过直接树脂吸附离子交换法制得的溶菌酶的纯度也达到86％，但是，该方法制备得到的溶菌酶不能经由纤维化加工形成蛋白质纤维，而是导致了大量蛋白质沉淀。
技术实现思路
[0003]本专利技术旨在提供一种适于纤维化加工的蛋清溶菌酶的简易提取纯化方法。
[0004]本方案的技术方案如下：
[0005]1.适于纤维化加工的蛋清溶菌酶的简易提取纯化方法，其特征在于：
[0006](1)在新鲜鸡蛋清(pH＞8.0)中加入2倍体积的pH 6.5磷酸盐缓冲液，使用摩尔浓度为2的盐酸调节pH至4.6，于80℃水浴锅中加热20分钟。冷却至室温后，离心，取上清液a；
[0007](2)在步骤(1)获得的上清液a中加入固体硫酸铵粉末使其饱和度达到40％，静置2
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4小时，离心，取上清液b；
[0008](3)在步骤(2)获得的上清液b中加入固体硫酸铵粉末使其饱和度达到80％，静置2
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4小时，离心，取沉淀c；
[0009](4)将步骤(3)中获得的沉淀c复溶，透析三天后，将透析液与D152大孔弱酸性阳离子交换树脂以4∶1的比例混合，置于摇床中，以120转/分钟的转速吸附6小时，充分洗涤树脂至无泡沫形成，抽滤；
[0010](5)在抽滤得到的树脂中加入等体积的pH 6.5磷酸盐缓冲液，置于摇床中，以120
转/分钟的转速洗涤20分钟，抽滤；
[0011](6)重复步骤(5)；
[0012](7)在抽滤得到的树脂中加入等体积的10％硫酸铵溶液，置于摇床中，以120转/分钟的转速洗脱1小时，抽滤；
[0013](8)重复步骤(7)两次；
[0014](9)收集洗脱液，加入固体硫酸铵粉末使其饱和度达到60％，静置过夜，离心取上清，经透析、冻干后，得到溶菌酶冻干粉；
[0015](10)称取一定质量步骤(9)得到的溶菌酶冻干粉，溶于超纯水中制得2wt％的鸡蛋清溶菌酶蛋白溶液，静置过夜；
[0016](11)将步骤(10)得到的蛋白溶液用摩尔浓度为2的盐酸调节pH至2.0，在90℃下加热孵育8小时即可制得鸡蛋清溶菌酶淀粉样纤维。
[0017]本专利技术具有以下优点：
[0018]利用等电点法加热沉淀部分杂蛋白，再联合树脂吸附离子交换法进行溶菌酶提取，操作简易，设备要求少，制备得到的溶菌酶适用于蛋白质纤维的制备。
附图说明
[0019]图1 SDS
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PAGE检测提取的溶菌酶的纯度
[0020]图2不同溶菌酶提取方法对蛋白质纤维化加工的影响
[0021]图3溶菌酶纤维的原子力显微镜(AFM)图
具体实施方式
[0022]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本专利技术实施例对本专利技术实施例中的技术方案进行进一步描述。所描述的实施例是本专利技术的部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]实施例一：直接树脂吸附离子交换法制备蛋清溶菌酶
[0024](1)取新鲜鸡蛋清(pH＞8.0)与D152大孔弱酸性阳离子交换树脂以4∶1的比例混合，置于摇床中，以120转/分钟的转速吸附6小时，充分洗涤树脂至无泡沫形成，抽滤；
[0025](2)在抽滤得到的树脂中加入等体积的pH 6.5磷酸盐缓冲液，置于摇床中，以120转/分钟的转速洗涤20分钟，抽滤；
[0026](3)重复步骤(2)；
[0027](4)在抽滤得到的树脂中，加入等体积的10％硫酸铵溶液，置于摇床中，以120转/分钟的转速洗脱1小时，抽滤；
[0028](5)重复步骤(4)两次；
[0029](6)收集洗脱液，加入固体硫酸铵粉末使其饱和度达到60％，静置过夜，离心取上清，经透析、冻干后，得到溶菌酶冻干粉；
[0030](7)将步骤(6)所得的溶菌酶冻干粉和Sigma购买的鸡蛋清溶菌酶(L
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6876)用于SDS
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PAGE实验。电泳上样样品是将样品用适量pH 2水溶解后与4
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上样缓冲液以3∶1的比例进行混合，沸水浴5min制得；SDS
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PAGE实验中所用分离胶浓度为15％，浓缩胶浓度为5％；样
品先在80V下进行电泳，待溴酚蓝达到浓缩胶底部后改变电压至110V，继续进行电泳至溴酚蓝达到分离胶底部，取下凝胶，使用考马斯亮蓝R250染色30min，然后用甲醇(45％)、冰醋酸(10％)混合液进行洗脱，直至去除背景色。凝胶用Tanon
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2500成像，结果如图1A所示，并用ImageJ对图像进行分析计算得到溶菌酶纯度，结果如图1B所示，其中泳道1为鸡蛋清溶菌酶标准品，泳道2为实施例一步骤(1)
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(6)所得的溶菌酶冻干粉；
[0031](8)称取一定质量步骤(6)得到的溶菌酶冻干粉，溶于超纯水中制得2wt％的鸡蛋清溶菌酶蛋白溶液，静置过夜；
[0032](9)将步骤(8)得到的蛋白溶液用摩尔浓度为2的盐酸调节pH至2.0，在90℃下加热孵育8小时，溶液在偏振光下的照片如图2A所示。
[0033]从图1的泳道2结果可以发现，树脂直接共混离子交换法制备得到的溶菌酶纯度为86.19％。从图2A的结果来看，经酸热处本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种适于纤维化加工的蛋清溶菌酶的简易提取纯化方法，其特征在于所述方法包含以下步骤：(1)在新鲜鸡蛋清(pH＞8.0)中加入2倍体积的pH 6.5磷酸盐缓冲液，使用摩尔浓度为2的盐酸调节pH至4.6，于80℃水浴锅中加热20分钟。冷却至室温后，离心，取上清液a；(2)在步骤(1)获得的上清液a中加入固体硫酸铵粉末使其饱和度达到40％，静置2
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4小时，离心，取上清液b；(3)在步骤(2)获得的上清液b中加入固体硫酸铵粉末使其饱和度达到80％，静置2
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4小时，离心，取沉淀c；(4)将步骤(3)中获得的沉淀c复溶，透析三天后，将透析液与D152大孔弱酸性阳离子交换树脂以4∶1的比例混合，置于摇床中，以120转/分钟的...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡冰，何晓倩，粘颖群，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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