用于培养细胞的方法和过程技术

培养的海鲜肌细胞通过以下过程生产：首先使用机械和酶促手段从组织中分离培养起始细胞，然后在培养中随时间的推移扩增其数量。用于提高海鲜肌细胞产量的方法用于制造海鲜产品。品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于培养细胞的方法和过程
[0001]相关申请的引证
[0002]本申请要求于2020年12月30日提交的美国临时申请号63/132084的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。


[0003]本公开一般涉及培养的细胞、食品和肉类，包含海鲜。

技术介绍

[0004]细胞农业/水产养殖是一个新兴产业，意图解决现代食物生产已经开始遇到并且随着全球人口的增长将变得更加急迫的困难，预计2050年全球人口将达到约100亿。该产业试图通过减少现代农业的环境影响和改善动物福利以更可持续的方式生产动物蛋白。
[0005]细胞农业/水产养殖不是使整个动物生长作为食物，而是使用在培养物中生长和扩增的干细胞(主要是卫星细胞或成肌细胞)作为原料来生产食用肉类。虽然在科学上这是一个可行的想法，但是存在一些技术和财政上的挑战。扩大规模、商品成本、能源消耗、建立在结构和质地上与天然肉类相似的3D构造以及保持风味是成功的细胞基食物产品或培养的肉类必须克服的一些主要挑战。
[0006]特别地，培养海鲜肉类仍然是主要挑战。

技术实现思路

[0007]在一个方面，提供了一种用于提高从样品细胞培养物中培养的肌祖细胞的产量的方法，所述样品细胞培养物包括培养基中的多种细胞类型，所述方法包括：(a)将所述样品细胞培养物铺板在第一表面上；(b)将所铺板的细胞培养物培养足够的时间以使所述肌祖细胞粘附到所述第一表面上；(c)收集所述培养基的包括未粘附的肌祖细胞的至少一部分；以及(d)将从(c)所收集的培养基再铺板到另一个表面上以使所述未粘附的肌祖细胞粘附到所述另一个表面上。
[0008]在另一个方面，提供了一种生产食物产品的方法，所述方法包括：a)从自死后生物体或死后生物体的身体部位获得的组织样品中提取细胞；以及b)从所述组织样品中分离，并且培养肌祖细胞成为食物产品。
[0009]在另一个方面，提供了一种用于从组织样品中分离肌祖细胞的方法，其包括使用至少一个密度梯度将所述肌祖细胞与至少一种其它细胞或细胞碎片分离。
[0010]在又一个方面，提供了一种由本文所述方法制备的食物产品，所述食物产品包括：a)第一鱼肌细胞；和b)海鲜细胞。在又一个方面，提供了一种由本文所述方法制备的食物产品，所述食物产品包括：a)培养的鱼肌细胞，其是单独的或与b)其它培养的细胞、c)动物源性成分和/或d)非动物源性成分组合。
[0011]对于本领域技术人员而言，在阅读本公开后，许多关于本文所述实施例的进一步特征及其组合将是显而易见的。
附图说明
[0012]在如此一般描述本专利技术的性质之后，现在将参考附图，通过说明的方式显示本专利技术的优选实施例，并且其中：
[0013]图1显示了源自死后储存1至17天的罗非鱼的培养的细胞的产量图。数据是在每个时间点相对于由单一实验生产的处理组织量标准化的培养产量。
[0014]图2显示了培养的细胞的产量的柱状图。A)显示了用胶原蛋白酶和TrypLE处理组织后的培养的细胞的产量。在仅TrypLE步骤后(左起第一柱，中蓝色，n＝3)，或在胶原蛋白酶和TrypLE孵育后(左起第二柱，灰色，n＝2)，或在随后单独用Ficoll
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Paque进行密度梯度离心后(左起第三柱，浅蓝色，n＝6)，或在依次的Ficoll
‑
Paque和Percoll梯度后(左起第四柱，深蓝色，n＝4)收集细胞。B)显示了数据，其来自直接比较使用酶孵育后的细胞开始培养的细胞产量与使用Ficoll
‑
Paque密度梯度分离后的细胞开始培养的细胞产量的实验。
[0015]图3显示了来自肌细胞培养物第二天的图像。左边的图像显示了在酶处理后直接开始的肌细胞培养物的第二天。右边的图像显示了在Ficoll
‑
Paque密度梯度分离后开始的肌细胞培养物的第二天。
[0016]图4显示了在同一天拍摄的原始和连续再接种培养物的图像。左边的图显示了在其第6天拍摄的原始培养物。中间的图显示了在其第5天拍摄的第一再接种培养物。右边的图显示了在其第4天拍摄的第二再接种培养物。所有三个培养物中都可以看到粘附的肌细胞。
[0017]图5显示了初次接种培养物后第1天的图像。可以看到沉淀的细胞主要以圆形形状。
[0018]图6显示了在培养的最初几天内，肌细胞(纺锤形形状)和成纤维细胞(不规则形状)的独特形态的图像。示例性肌细胞和成纤维细胞用黑色箭头表示。该图像拍摄自原代培养物第4天。
[0019]图7显示了生长旺盛的培养物的图像，该培养物表现出大约70％
‑
80％的汇合度。该图像从原代培养物第9天获得。
[0020]图8显示了原代培养物(T21)的细胞核中Pax3表达的图像。白色箭头表示图像中展示Pax3表达的区域。所有的细胞核都用DAPI染色(以蓝色成像)，而Pax3染色通过红色荧光可视化，从而导致细胞核呈微红色至紫色。
[0021]图9显示了第一代细胞培养物(T23)中结蛋白(以红色成像)表达的图像。细胞核用DAPI染色(以紫色成像)。
[0022]图10显示了来自2个独立培养物(T21和T23)的培养的细胞的肌源分化。左边的图像对应于对照培养物，而右边的图像对应于在低血清分化培养基中维持的培养物。黑色箭头表示肌管。
[0023]图11显示了鱼肌肉源性细胞的骨骼肌分化和蛋白质表达。A)显示BCA蛋白测定结果的柱状图，该结果表明未分化和分化的鲷鱼细胞的平均蛋白质浓度(以每毫升细胞裂解物中蛋白质的毫克数表示)。培养物GS7、GS8和GS10。B)和C)图像显示了分化培养物中多核肌管中肌节α
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肌动蛋白(B，白色实心箭头)和肌球重链(C，白色实心箭头)的表达。细胞核用DAPI染色(白色边界箭头)。比例尺为20μm。
[0024]图12说明了细胞培养物连续再铺板的流程图。
[0025]图13显示了培养倍增时间对初始接种密度的依赖性。
具体实施方式
[0026]本公开提供了用于生产培养的肉类和海鲜的方法和过程。通过本文所述的方法和过程制备的培养的肉类和海鲜意图用于生产供人类食用的食物产品。
[0027]在特定的实施例中，提供了用于生产培养的海鲜的方法和过程。如本文所用，“海鲜”是指从水源(如海、洋、河或湖)获得的可食用食物，并且包含动物和植物。海鲜的类别包含鱼类、贝类(软体动物和甲壳纲动物)、海参和海藻或海洋植物。
[0028]鱼类的实例包含但不限于：鳀鱼、梭鱼、鲈鱼、黑鳕鱼、河豚、竹荚鱼、龙头鱼、鳊鱼、鲽类鱼、鲳鱼、鲶鱼、智利海鲈鱼、鳕鱼、狗鲨、真鲷、鳗鱼、比目鱼、石斑鱼、黑线鳕、狗鳕、大比目鱼、鲱鱼、虎皮鱼、海鲂鱼、七鳃鳗、长蛇齿单线鱼、鲭鱼、鬼头刀鱼、鮟鱇鱼、鲻鱼、橘刺鲷、鹦嘴鱼、河鲈、梭子鱼、皮尔彻德鱼、明太鱼、鲳鱼、鲳参鱼、裸盖鱼、鲑鱼、沙孙鲽、沙丁鱼、海鲈鱼、河鲱、鲨鱼、鳐鱼、胡瓜鱼、黑鱼、鲷鱼、鳎鱼、西鲱、鲟鱼、食糜、剑鱼本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种提高从样品细胞培养物中培养的肌祖细胞的产量的方法，所述样品细胞培养物包括培养基中的多种细胞类型，所述方法包括：(a)将所述样品细胞培养物铺板在第一表面上；(b)将所铺板的细胞培养物培养足够的时间以使所述肌祖细胞粘附到所述第一表面上；(c)收集所述培养基的包括未粘附的肌祖细胞的至少一部分；以及(d)将从(c)所收集的培养基再铺板到另一个表面上以使所述未粘附的肌祖细胞粘附到所述另一个表面上。2.根据权利要求1所述的方法，其中重复步骤(c)和(d)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括用洗涤培养基洗涤各铺板的细胞培养物，收集所述洗涤培养基，并且将所述洗涤培养基铺板到第二表面上。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其包括在(a)之前，从生物体获得组织样品，并且过滤所述组织样品，以获得所述样品细胞培养物。5.根据权利要求4所述的方法，其中过滤所述组织样品包括以下的一项或多项：i)所述样品组织的酶促解离以提取细胞；ii)密度梯度分离使用分离培养基以分离碎片；iii)密度梯度分离以分离肌源细胞和成纤维细胞；iv)密度梯度分离以分离肌源细胞和血细胞；v)密度梯度分离，其可变梯度范围为1.02g/mL至1.08g/mL；以及vi)离心。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述分离培养基是Ficoll
‑
Paque。7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其包括从死后生物体获得所述组织样品。8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中所述组织样品是动物组织。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述组织样品是海鲜动物组织。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述组织样品是鱼组织。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表面涂有含或不含聚赖氨酸的层粘连蛋白、含或不含聚赖氨酸的明胶、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、Matrigel
TM
或Geltrex
TM
。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述表面涂有鱼明胶。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述表面包括微载体表面。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述培养基根据所述培养基的胎牛血清(FBS)含量补充有成纤维细胞生长因子
‑
2(FGF
‑
2)。15.根据权利要求14所述的方法，其中当所述培养基的FBS含量低于10％时，所述培养基包括至少5ng/ml的FGF
‑
2。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其进一步包括将所粘附的肌祖细胞培养和增殖到目标细胞密度和/或量以制成食物产品。17.一种生产食物产品的方法，所述方法包括：a)从自死后生物体或死后生物体的身体部位获得的组织样品中提取细胞；以及b)从所述组织样品中分离，并且培养肌祖细胞成为食物产品。18.根据权利要求17所述的方法，其包括根据权利要求1至15中任一项所述的方法提高
来自所提取的细胞的肌祖细胞的产量。19.根据权利要求17所述的方法，其包括将所述肌祖细胞培养到支架结构上。20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其包括从所述死后生物体或所述死后生物体的身体部位获得所述组织样品。21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中a)提取细胞包括以下的一项或多项：i)所述样品组织的酶促解离以提取细胞；ii)密度梯度分离使用分离培养基以分离碎片；iii)密度梯度分离以分离肌源细胞和成纤维细胞；iv)密度梯度分离以分离肌源细胞和血细胞；v)密度梯度分离，其可变梯度范围为1.02g/mL至1.08g/mL；以及vi)离心。22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中培养所述肌祖细胞包括将所分离的肌祖细胞与至少一种能够分泌生长刺激信号的其它类型的细胞一起培养。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述至少一种其它类型的细胞是同种异体或自体细胞。24.根据权利要求22所述的方法，其中所述至少一种其它类...

【专利技术属性】
技术研发人员：瓦伦丁，
申请(专利权)人：细胞农业科技公司，
类型：发明
国别省市：