一种蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法，包括以下步骤：S1)利用BLAST比对分析待测蛋白质样品理论酶解肽段的专属性和特异性，得到候选肽段；S2)预测候选肽段在质谱能量作用下肽键断裂产生的b、y离子碎片；将待测蛋白质样品酶解，得到酶解液后，利用低分辨质谱对候选肽段进行分析，得到二级指纹谱图；S3)将所述二级指纹谱图与b、y离子碎片进行匹配，得到特征肽段。与现有技术相比，本发明专利技术仅通过低分辨质谱即可满足复杂食品基质中蛋白质定量用特征肽段的全面筛选，筛选出适用于蛋白质准确定量的特征肽段，实现灵敏度高，精密度好，重现性好的蛋白质定量检测，且操作简单、成本低、易推广。易推广。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法


[0001]本专利技术属于食品检测
，尤其涉及一种蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法。

技术介绍

[0002]液相色谱质谱已经成为食品蛋白质定量分析的最先进的工具，是一种新型的蛋白组学检测技术，基于基因组学与靶向蛋白组学的研究思路，实现目标蛋白质组中多种蛋白的准确定量。蛋白组学质谱技术简单来说就是一种将质谱仪用于研究蛋白质的技术。它的基本原理是蛋白质经过特定的蛋白酶酶切消化后成肽段混合物，在质谱仪中肽段混合物电离形成带电离子，质谱分析器的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(即质荷比，M/Z)的肽段离子分离开来，经过检测器收集分离的离子，确定每个离子的质核比。
[0003]目前，食品中蛋白质定量肽段的筛选主要通过高分辨质谱结合蛋白组学软件，对人员、硬件以及软件都提出了较高的要求，一些中、小型食品企业不具备高分辨质谱以及蛋白组学软件，此外，一些蛋白组学软件并不是包含所有的蛋白肽段信息，将无法实现所有肽段的筛选，具有一定的局限性。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种操作简便、成本较低且易推广的蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法。
[0005]本专利技术提供了一种蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法，包括以下步骤：
[0006]S1)利用BLAST比对分析待测蛋白质样品理论酶解肽段的专属性和特异性，得到候选肽段；
[0007]S2)预测候选肽段在质谱能量作用下肽键断裂产生的b、y离子碎片；/>[0008]将待测蛋白质样品酶解，得到酶解液后，利用低分辨质谱进行分析，得到二级指纹谱图；
[0009]S3)将所述二级指纹谱图与b、y离子碎片进行匹配，得到特征肽段。
[0010]优选的，所述步骤S1)中使用ExPASy peptide cutter工具模拟酶切待测蛋白质样品，得到待测蛋白质样品理论酶解肽段；
[0011]利用BLAST比对分析待测蛋白质样品理论酶解肽段的专属性和特异性选择与待测蛋白质样品理论酶解肽段100％匹配的1～5个物种特性的肽段，得到候选肽段。
[0012]优选的，所述步骤S1)中使用ExPASy peptide cutter工具模拟胰蛋白酶酶切待测蛋白质样品，得到待测蛋白质样品理论酶解肽段；所述待测蛋白质样品理论酶解肽段包括7～20个氨基酸。
[0013]优选的，所述步S2)预测候选肽段在质谱能量作用下肽键断裂产生的分子量在200～2000所有的b、y离子碎片。
[0014]优选的，所述步骤S2)中待测蛋白质样品采用胰蛋白酶进行酶解；酶解的时间为1
～6h。
[0015]优选的，所述步骤S2)中酶解液先经液相色谱分离，然后利用低分辨质谱进行分析；
[0016]所述液相色谱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；所述液相色谱的流动相包括流动相A与流动相B；所述流动相A为0.05～0.2wt％酸性水溶液；所述流动相B为0.05～0.2wt％酸性有机溶液；以体积百分数计，所述液相色谱的洗脱程序为：0～1min，95％流动相A；1～3min，5％流动相B～40％流动相B；3～5min，40％流动相B～100％流动相B；5～7min，100％流动相B；7～9min，100％流动相B～5％流动相B。
[0017]优选的，所述步骤S2)中利用低分辨质谱进行分析具体为：
[0018]将酶解液通过低分辨质谱母离子扫描模式、子离子扫描模式与二级质谱全扫描模式进行分析，得到二级指纹谱图。
[0019]优选的，所述母离子扫描模式筛选的母离子带2～4个电荷；所述母离子的质荷比为500～2000。
[0020]优选的，所述低分辨质谱的离子源模式为ESI，正离子模式；毛细管电压为3～4kV；离子源温度为140℃～180℃；脱溶剂温度为500℃～700℃；脱溶剂气流量为800～1200L/Hr；碰撞室气流量为0.1～0.25mL/min。
[0021]优选的，还包括S4)：将待测蛋白质样品与加标物混合后得到加标样，分别测量加标样酶解生成的候选特征肽段的回收率和精密度，对特征肽段性能进行确证和/或定量检测。
[0022]本专利技术还提供了一种上述筛选方法筛选得到的特征肽段在蛋白质定性检测和/或定量检测中的应用。
[0023]本专利技术提供了一种蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法，包括以下步骤：S1)利用BLAST比对分析待测蛋白质样品理论酶解肽段的专属性和特异性，得到候选肽段；S2)利用理论预测候选肽段在质谱能量作用下肽键断裂产生的b、y离子碎片；将待测蛋白质样品酶解，得到酶解液后，利用低分辨质谱进行分析，得到二级指纹谱图；S3)将所述二级指纹谱图与b、y离子碎片进行匹配，得到特征肽段。与现有技术相比，本专利技术仅通过低分辨质谱即可满足复杂食品基质中蛋白质定量用特征肽段的全面筛选，筛选出适用于蛋白质准确定量的特征肽段，可为复杂食品基质中蛋白质定量提供特征肽段，满足液相色谱串联质谱法对食品基质中蛋白质的定量检测要求，实现灵敏度高，精密度好，重现性好的蛋白质定量检测，且操作简单、成本低、易推广。
附图说明
[0024]图1为本专利技术实施例1中使用ExPASy peptide cutter工具模拟蛋白质的胰蛋白酶解过程预测酶解肽段的具体检索结果图；
[0025]图2为本专利技术实施例1中得到的“GDSVAYGLK”二级碎片信息图；
[0026]图3为本专利技术实施例中骨桥蛋白特异肽段的多反应监测(MRM)色谱图；
[0027]图4为本专利技术实施例1中骨桥蛋白同位素内标特异肽段的多反应监测(MRM)色谱图。
具体实施方式
[0028]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0029]本专利技术提供了一种蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法，包括以下步骤：S1)利用BLAST比对分析待测蛋白质样品理论酶解肽段的专属性和特异性，得到候选肽段；S2)利用理论预测候选肽段在质谱能量作用下肽键断裂产生的b、y离子碎片；将待测蛋白质样品酶解，得到酶解液后，利用低分辨质谱进行分析，得到二级指纹谱图；S3)将所述二级指纹谱图与b、y离子碎片进行匹配，得到特征肽段。其中，本专利技术对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。
[0030]在本专利技术中，首选模拟预测待测蛋白质样品理论酶解肽段，优选使用ExPASy peptide cutter工具(https://web.expasy.org/peptide_cutter/)模拟酶切待测蛋白质样品，更优选使用ExPASy peptide cutter工具(https://web.expasy.org/peptide_cutter/)模拟胰蛋白酶酶切待测蛋白质样品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1)利用BLAST比对分析待测蛋白质样品理论酶解肽段的专属性和特异性，得到候选肽段；S2)预测候选肽段在质谱能量作用下肽键断裂产生的b、y离子碎片；将待测蛋白质样品酶解，得到酶解液后，利用低分辨质谱进行分析，得到二级指纹谱图；S3)将所述二级指纹谱图与b、y离子碎片进行匹配，得到特征肽段。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤S1)中使用ExPASy peptide cutter工具模拟酶切待测蛋白质样品，得到待测蛋白质样品理论酶解肽段；利用BLAST比对分析待测蛋白质样品理论酶解肽段的专属性和特异性选择与待测蛋白质样品理论酶解肽段100％匹配的1～5个物种特性的肽段，得到候选肽段。3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤S1)中使用ExPASy peptide cutter工具模拟胰蛋白酶酶切待测蛋白质样品，得到待测蛋白质样品理论酶解肽段；所述待测蛋白质样品理论酶解肽段包括7～20个氨基酸。4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤S2)预测候选肽段在质谱能量作用下肽键断裂产生的分子量在200～2000所有的b、y离子碎片。5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤S2)中待测蛋白质样品采用胰蛋白酶进行酶解；酶解的时间为1～6h。6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤S2)中酶解液先经液相色谱分离，然后利用低分辨质谱进行分析...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立佳，莫楠，刘丽君，唐烁，李翠枝，
申请(专利权)人：内蒙古伊利实业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：