一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）生产及收获方法，包括以下步骤：在转瓶中培养Ｍａｒｃ－１４５细胞，待细胞长成单层后，去掉生长液，按照０．０１个感染复数（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ？ｏｆ？ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）接种ＰＲＲＳＶ，３７℃吸附１ｈ，加入ＤＭＥＭ作为维持液进行病毒扩繁，置３７℃恒温室转瓶机上旋转培养７２～８４ｈ，当出现７５％～８０％细胞病变（ＣＰＥ）时，直接收集上清，即获得ＰＲＲＳＶ。本发明专利技术减少了粗制抗原中的过敏源，提高了疫苗质量；同时，Ｍａｒｃ－１４５细胞出现ＣＰＥ的时间与工艺改进前一致，但缩短了病毒收获时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种病毒培养方法。
技术介绍
繁殖与呼吸综合征(PRRS)自1987年在美国被发现以来，几乎已扩散到全球所有 养猪业发达的国家和地区，临床症状以母猪繁殖障碍及仔猪呼吸系统疾病为主要特征。高 致病性猪蓝耳病，即是由猪繁殖与呼吸综合征(俗称蓝耳病)病毒变异株引起的一种急性 高致病性疫病，该病已经给世界养猪业造成巨大经济损失。有效的疫苗免疫是控制该病的 重要措施，为大量制备病毒抗原，必须获得足够的病毒。通常采用在细胞上增殖的方式扩繁 病毒。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对细胞有严格的选择性，其中Marc-145细胞是近 年来应用较多的细胞，该细胞适应范围广，对PRRSV敏感性强，病毒可以达到较高滴度，因 而得到广泛应用。但PRRSV的滴度受到多重因素的影响，其中细胞培养是病毒增殖的前提， 细胞培养的质量决定着病毒毒价的高低。 目前，国内生产PRRSV主要采用转瓶技术培养Marc-145细胞，待其贴壁长满后，弃 去生长液，接种PRRSV种子，添加含2%新生牛血清的DMEM培养液作为细胞维持液，在37°C 下培养，当感染细胞出现75% 80%细胞病变(CPE)时，将转瓶置于(-2(TC )冰箱或冷库 中，待其完全结冰后取出解冻，解冻过程中不断转动转瓶，使冰块刮落贴壁的细胞，等冰块 完全溶解后再冻存于冷库中，如此反复冻融三次后收集病毒液。当前猪蓝耳病病毒(PRRSV) 培养使粗制抗原中残留有大量牛血清等过敏源，给疫苗的使用带来一定的安全隐患。另外， 病毒液收获所需时间长、程序比较繁琐造成工人劳动强度大。因此，亟待对目前的PRRSV生 产及收获方法进行改进。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种节约成本、安全可靠的猪繁殖与 呼吸综合征病毒(PRRSV)生产及收获方法。 本专利技术通过以下方案实现上述目的。 —种猪繁殖与呼吸综合征病毒生产及收获方法，包括以下步骤以添加10%新生 牛血清的DMEM作为生长培养基培养宿主细胞，去掉生长液后，接种一定量的PRRSV，37t:吸 附lh，加入维持液进行病毒扩繁，其特征在于所述的维持液为不添加血清的DMEM培养液。 当病毒扩繁至宿主细胞出现75% 80%病变时，收集上清，即获得猪繁殖与呼吸综合征病毒。 所述的宿主细胞为Marc-145，整个培养过程在转瓶机中进行。Marc_145细胞是上 皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞(MA-104细胞)克隆而得到，可连续培养。细胞的培 养过程应注意1)细胞没有支原体等外源因子的感染。2)培养液的pH值可在7.0 7.3，以 7.2为佳。3) —般按l : 2传代，细胞接种密度为l 1.5X105cells/ml，48h后长成单层。 4)培养基和血清的质量可靠、稳定；建议采用特级新生牛血清。5)细胞及时传代，不可以在单层时进行传代、扩增。6)细胞传代时消化液用0.25%胰 蛋白酶+0. 03% EDTA，消化过程应尽量縮短在1 2分钟内完成。 所述的接种是按0. 01个感染复数(MOI-multiplicity of infection)接种 PRRSV。 PRRS病毒感染Marc-145细胞过程可大致分为两个感染阶段，第一阶段病毒感染 细胞后的20 22h左右，仅部分细胞被随机感染，而且Marc-145细胞对PRRS病毒的低感 染性(low permissiveness)与MOI量无关，因为MOI剂量比常规量提高100倍，感染22h 后，仍仅5. 5%的细胞呈PRRSV阳性(PRRSV-positive)。第二阶段感染后的48 72h (也称 为病毒的对数感染期)，病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞之间的接触感染，细胞对自由 病毒不敏感(Cells is nonpermissive to free Virus)，并出现了感染细胞群。可以采用 适当低量的MOI进行病毒感染，比如0. Olvirus/cell ;同时，大部分细胞在维持期的第一天 尚需继续生长，而且病毒在48 84h才是感染、增殖的高峰，较长的病毒维持期均需要供给 丰富的营养物资。 传代细胞培养中所用的细胞生长液为商品化的Gibco 31600034DMEM培养基加入 10%新生牛牛血清和1%双抗(青霉素和链霉素)。使用DMEM培养基前，按说明书要求配 成10L溶液，用NaHC03溶液调整ffl值至7. 2，用0. 22 y m滤膜正压过滤除菌，除菌后培养基置2t: 8t:避光保存。传代细胞培养中所用的细胞维持液为商品化的Gibco 31600034DMEM培养基。 所述的病毒扩繁过程是在37t:下，转瓶机中旋转培养72 84h。所用的维持液为 DMEM培养液，pH为7. 4 7. 8 ;后期维持pH会慢慢降下来。细胞病变时间出现在接毒后 48h， 72 84h细胞病变达75%左右，当细胞出现75% 80%以上CPE时，即可开始收毒。细 胞的病变现象为细胞空泡化、圆縮、先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。 本专利技术最重要的改进在于维持液和收毒工艺的改进。 DMEM是常用的细胞培养液，在现有的通用技术中，也一直认为添加2X小牛血清 的DMEM培养液作为细胞维持液，对PRRSV的扩繁效果更好。但是，目前的培养工艺容易导 致粗制抗原中残留一定浓度的牛血清蛋白，而牛血清蛋白是一种过敏源，可引起疫苗接种 动物出现过敏反应。另外，病毒液收获所需时间较长、程序繁琐且工人劳动强度大。 本专利技术创造性地将细胞维持液进行了调整，通过改变维持培养液的营养配比，尽 量减少过敏源的产生，同时并不会影响病毒的扩繁速率。另外，通过对病毒液收获方式的改 进而达到节省生产成本、降低劳动强度和提高生产效率的目的。本专利技术的所提供的生产方 法，其病毒的收毒工艺大大简化，大量试验表明，本专利技术所提供的方法只需要在细胞培养出 现75% 80% CPE时，取出上清液，即可以获得与传统方法繁琐的反复冻融后获得的病毒 含量相当。在工艺改进前，收获病毒液要经过-2(TC /常温的反复冻融过程，此过程一般需 2 3天，每天冻融细胞均须1名工人进行细胞的冻融工作。由于15000ml细胞转瓶体积较 大，为玻璃制品，稍有不慎容易破裂，因此从_201:取放的过程中须轻拿轻放，而且在解冻过 程中须不断转动转瓶，员工劳动强度较大。工艺改进后，直接收获细胞上清病毒液，不需反 复冻融过程，便可进入下一流程，节省2天冻融时间，大大提高了工作效率。 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果 1、本专利技术方法所生产的PRRSV，减少了粗制抗原中的过敏源，大大降低了由其获得4的抗原引起的过敏反应，提高了疫苗的质量；同时，Marc-145细胞出现CPE的时间与工艺改 进前一致，对扩繁的效率不会产生负面影响，收获的病毒液活毒含量差异不大，且毒价保持 2、本专利技术所提供的方法避免了收毒工艺中费时费力的反复冻融过程，縮短工艺流 程，降低劳动强度。 3、本专利技术所提供的方法不仅节省了牛血清采购费用，还节省了病毒液收获过程反 复冻融等操作，时间縮短了 2 3天，降低了工人的劳动强度，提升车间的生产能力，即节省 成本，又增强效能。 4、本专利技术所提供的方法节省-2(TC冰柜、冷库及其产生的相关费用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的生产方法，包括以下步骤：用生长液在转瓶中培养宿主细胞，待长成单层细胞后去掉生长液，接种适量ＰＲＲＳＶ，加入维持液进行病毒扩繁，其特征在于：所述的维持液为ＤＭＥＭ培养液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓雨修，宋延华，杨明柳，李春梅，文传洪，于琳忠，
申请(专利权)人：广东温氏食品集团有限公司，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]