具有肠道菌群和免疫调节功能的解淀粉芽孢杆菌JM033产胞外多糖及其应用制造技术

本发明专利技术公开了具有肠道菌群和免疫调节功能的解淀粉芽孢杆菌JM033产胞外多糖及其应用，属于微生物技术领域。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM033保藏于广东省微生物菌种保藏中心保藏，广州，保藏日期为2022年11月21日，保藏编号为GDMCC NO：62989。解淀粉芽孢杆菌JM033产胞外多糖，BAP

【技术实现步骤摘要】
具有肠道菌群和免疫调节功能的解淀粉芽孢杆菌JM033产胞外多糖及其应用


[0001]本专利技术涉及一种具有肠道菌群和免疫调节功能的解淀粉芽孢杆菌JM033产胞外多糖及其应用。属于微生物


技术介绍

[0002]胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是由微生物产生的一种具有结构多样性的生物聚合物。因其结构的多样性决定了EPS具有多种生物学活性，如抗氧化、抗病毒、抗癌和免疫调节等。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)是属于芽孢杆菌属的益生菌，具有较强的酶和碳水化合物合成能力，其产生的EPS具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和抗氧化等多种生物学活性。芽孢杆菌属中越来越多的益生菌被发现，但对这些益生菌相关的研究却较少，所以对芽孢杆菌属益生菌产胞外多糖的研究具有重要意义。
[0003]解淀粉芽孢杆菌是属于芽孢杆菌属的一种益生菌，研究表明其可以产生包括EPS在内的多种代谢物质。EPS是微生物产生一类具有多种优良理化性质的生物聚合物。目前EPS的研究热点集中于乳酸菌上，而某些芽孢杆菌可以产生比乳酸菌更多且新型结构的EPS。芽孢杆菌属益生菌产EPS和特性是目前的研究热点，筛选和发现能产生新型EPS大分子的潜力菌株和对新型EPS的研究具有重要意义。故亟需一种解淀粉芽孢杆菌JM033、胞外多糖及其应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种具有高产EPS能力的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033。<br/>[0005]同时，本专利技术提供了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产新型胞外多糖BAP
‑
1，具有安全性和肠道菌群和宿主免疫方面的作用。
[0006]同时，本专利技术提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产胞外多糖的制备方法，该法可将EPS产量从0.75mg/mL提高至5.34mg/mL，增加了6.12倍。
[0007]同时，本专利技术提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产胞外多糖在制备免疫调节药物中的应用。
[0008]同时，本专利技术提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产胞外多糖在制备缓解免疫抑制肠道菌群紊乱药物中的应用。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
[0010]解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033，保藏于广东省微生物菌种保藏中心保藏，广州，保藏日期为2022年11月21日，保藏编号为GDMCC NO：62989。
[0011]解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产胞外多糖，BAP
‑
1是中性多糖，分子量为17.6kDa，构型为球形，BAP
‑
1由两种单糖组成，其中果糖占99.15％，葡萄糖占0.85％；BAP
‑
1是重复单元主链为13个(2
→
1)链接的β
‑
D
‑
呋喃果糖，支链是(2
→
6)链接的
β
‑
D
‑
呋喃果糖的混合型果聚糖。
[0012]解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0013]S01，根据解淀粉芽孢杆菌JM033可转运的碳源作为优化碳源种类并分别以100g/L添加到LB液体培养基中，结果显示蔗糖作为碳源的LB液体培养基中EPS产量最高，故最终优选蔗糖作为碳源；
[0014]S02，解淀粉芽孢杆菌JM033胞外粗多糖的制备：以蔗糖作为碳源，在37℃，pH为7.0的条件下发酵50h，接种量为2％、摇床转速为180rpm/min进行发酵的发酵液，经20000g离心15min；取上清液加入3倍体积提前预冷却至4℃的无水乙醇，于4℃静置沉淀48h；经12000g离心15min后取沉淀；将沉淀溶解于适量去离子水中，去离子水的加入量相当于沉淀的10倍体积，获得混悬液，加入相当于混悬液1/4体积的Sevage试剂，混匀后以180rpm震荡2h，离心，取水相并重复上述操作，直至水相与有机相的交界处没有蛋白存在，将水相置于透析袋中，透析袋截留分子量为8000
‑
13000Da，透析3d，每8h换水，透析液进行真空冷冻干燥，最后获得粗多糖样品；
[0015]S03，离子交换纯化：粗多糖样品被应用于DEAE
‑
纤维素柱，粗多糖样品用蒸馏水溶解后上样，以4mL/min的速度依次用蒸馏水洗脱，然后用0.1mol/L、0.2mol/L和0.3mol/L氯化钠洗脱；收集蒸馏水洗脱的馏分，浓缩，用蒸馏水透析48
‑
72h，透析袋截留分子量为3000Da，获得BAP
‑
1粗品；
[0016]S04，凝胶纯化：将BAP
‑
1粗品加载到Sephacryl S
‑
400HR柱上，BAP
‑
1粗品用蒸馏水溶解后上样，用蒸馏水洗脱60个柱体积，流速为1.0mL/min，收集每个柱体积获得的溶液并检测多糖的含量和纯度，合并多糖纯度≥90％的组分，冻干，获得BAP
‑
1。
[0017]DEAE
‑
纤维素柱为26mm
×
400mm；每15mL接一管，蒸馏水洗脱液接26管，0.1mol/L氯化钠洗脱液接13管，0.2mol/L氯化钠洗脱液接10管，0.3mol/L氯化钠洗脱液接10管。
[0018]Sephacryl S
‑
400HR柱为26mm
×
1000mm。
[0019]解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产胞外多糖在制备免疫调节药物中的应用。
[0020]解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产胞外多糖在制备缓解免疫抑制肠道菌群紊乱药物中的应用。
[0021]本专利技术具有以下有益效果：
[0022]本研究根据磷酸转移酶相关基因对B.amyloliquefaciens JM033发酵基质碳源进行筛选，优化发酵条件提高EPS产量。对B.amyloliquefaciens JM033所产EPS进行提取、分离和纯化，选取中性多糖组分(BAP
‑
1)进行结构解析。根据结构解析结果进行构效分析，通过体外细胞试验证明BAP
‑
1的安全性和免疫调节能力。通过环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)处理小鼠建立免疫抑制模型，在体内从本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM033，其特征在于，保藏于广东省微生物菌种保藏中心保藏，广州，保藏日期为2022年11月21日，保藏编号为GDMCC NO：62989。2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM033产胞外多糖，其特征在于，BAP
‑
1是中性多糖，分子量为17.6kDa，构型为球形，BAP
‑
1由两种单糖组成，其中果糖占99.15%，葡萄糖占0.85%；BAP
‑
1是重复单元主链为13个(2
→
1)链接的β
‑
D
‑
呋喃果糖，支链是(2
→
6)链接的β
‑
D
‑
呋喃果糖的混合型果聚糖，BAP
‑
1具有肠道菌群和免疫调节功能。3.根据权利要求2所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S01，根据解淀粉芽孢杆菌JM033可转运的碳源作为优化碳源种类并分别以100g/L添加到LB液体培养基中，结果显示蔗糖作为碳源的LB液体培养基中EPS产量最高，故最终优选蔗糖作为碳源；S02，解淀粉芽孢杆菌JM033胞外粗多糖的制备：以蔗糖作为碳源，在37℃，pH为7.0的条件下发酵50h，接种量为2%、摇床转速为180 rpm/min进行发酵的发酵液，经20000g离心15min；取上清液加入3倍体积提前预冷却至4℃的无水乙醇，于4℃静置沉淀48h；经12000 g离心15 min后取沉淀；将沉淀溶解于适量去离子水中，去离子水的加入量相当于沉淀的10倍体积，获得混悬液，加入相当于混悬液1/4体积的Sevage试剂，混匀后以180 rpm震荡...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜毓君，张宇，满朝新，李鸿萱，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：