本发明专利技术涉及基因工程领域，公开了一种耦合机器学习结合机制引导的乙酰辅酶A合成酶改造策略及其应用。该乙酰辅酶A合成酶突变体为将具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的酶在第112位、第184位、第223位、第256位、第260位、第360位、第449位、第469位、第504位和第612位中的至少一位进行突变。本发明专利技术还提供一种编码乙酰辅酶A合成酶突变体的基因，一种重组载体，一种重组菌株，一种乙酰辅酶A合成酶突变体的制备方法，一种酶制剂以及它们的应用。该乙酰辅酶A合成酶突变体具有优异的催化活性，在藤仓赤霉菌中过表达该突变体可有效提高赤霉素的产量。中过表达该突变体可有效提高赤霉素的产量。中过表达该突变体可有效提高赤霉素的产量。
【技术实现步骤摘要】
耦合机器学习结合机制引导的乙酰辅酶A合成酶改造策略及其应用
[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体地，涉及一种耦合机器学习结合机制引导的乙酰辅酶A合成酶改造策略及其应用。
技术介绍
[0002]乙酰辅酶A合成酶(acetyl
‑
CoA synthetase，乙酰CoA合成酶或者ACS)又名乙酰辅酶A连接酶、乙酸硫激酶、乙酰基激活酶、酰基激活酶，其在原核生物和真核生物中均有存在并属于代谢核心酶，广泛发现于各类细胞器及组织中。
[0003]乙酰CoA合成酶对大部分生物中醋酸盐向乙酰CoA的转化过程起主要作用，其从属于acyl
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adenylate
‑
forming enzyme超家族；在真核生物中，其是唯一催化醋酸盐活化反应的酶，因此，较之原核生物中的ACS，真核生物中的ACS更加重要，因为只有通过它才能使真核生物体内维持一定水平的乙酰CoA。具体说来，醋酸转化为乙酰辅酶A是一种不可逆催化过程，主要分为两步，第一步，醋酸盐在ACS的作用下消耗ATP形成乙酰
‑
AMP(acetyl
‑
AMP)中间体，第二步，乙酰
‑
AMP中间体在ACS作用下与CoASH反应形成acetyl
‑
CoA和AMP。ACS中Mg
2+
是其重要的辅助因子，然而Ca
2+
和Mn
2+
也可替代Mg
2+
作为ACS的辅助因子，提高ACS的催化水平会导致醋酸盐更多地向乙酰CoA的转化，同时可以增加脂肪酸合成途径的速率。已有研究报道在大肠杆菌E.coli中过表达ACS基因，使其活性增强9倍多，这导致醋酸盐积累的减少、物质流涌向乙酰CoA。
[0004]酶工程在为生物技术、生物医学和生命科学开发高效生物催化剂方面发挥着核心作用，通过酶改造可提升酶的活性，现有的酶改造方法主要有理性设计和定向进化方法，但在应用于乙酰CoA合成酶时，对其酶活性的提升效果有限。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种耦合机器学习结合机制引导的乙酰辅酶A合成酶改造策略及其应用，获得的乙酰辅酶A合成酶突变体具有优异的催化活性，在藤仓赤霉菌中过表达该突变体可有效提高赤霉素的产量。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种耦合机器学习结合机制引导的乙酰辅酶A合成酶突变体，该乙酰辅酶A合成酶突变体为将具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的酶在第112位、第184位、第223位、第256位、第260位、第360位、第449位、第469位、第504位和第612位中的至少一位进行突变。
[0007]优选地，该乙酰辅酶A合成酶突变体为将具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的酶进行(1)
‑
(10)中至少一种所述的突变：
[0008](1)第112位组氨酸H突变为色氨酸W；
[0009](2)第184位甘氨酸G突变为谷氨酸E；
[0010](3)第223位脯氨酸P突变为甘氨酸G；
H469T的催化活性提升230.5％。
附图说明
[0034]图1是实施例4中乙酰辅酶A合成酶的酶活测定的原理图；
[0035]图2是实施例4中乙酰辅酶A合成酶的酶活测定时吸光值
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时间曲线图；
[0036]图3是实施例5中质粒PfFCas9
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Bik5
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ACS H496T的质粒图谱；
[0037]图4是实施例5中质粒PfFCas9
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Bik5
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ACS的质粒图谱。
具体实施方式
[0038]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0039]本专利技术第一方面提供一种耦合机器学习结合机制引导的乙酰辅酶A合成酶突变体，该乙酰辅酶A合成酶突变体为将具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的酶在第112位、第184位、第223位、第256位、第260位、第360位、第449位、第469位、第504位和第612位中的至少一位进行突变。
[0040]本专利技术的专利技术人在研究过程中，通过AI机器学习的酶工程改造技术对藤仓赤霉菌来源的野生型乙酰辅酶A合成酶(简称野生型ACS，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)进行突变；具体地，通过先进的机器学习算法模型ESM
‑
1v以及打分排序，获得前19个可突变的氨基酸残基位点，并获得20个潜在单突变体；通过对各个ACS突变体的酶活进行测定，与野生型ACS作比较，筛选出10个可突变的氨基酸残基位点——第112位、第184位、第223位、第256位、第280位、第360位、第449位、第469位、第504位和第612位，能够明显提高ACS催化活性。
[0041]根据本专利技术，优选地，该乙酰辅酶A合成酶突变体为将具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的酶进行(1)
‑
(10)中至少一种所述的突变：
[0042](1)第112位组氨酸H突变为色氨酸W，以H112W表示；
[0043](2)第184位甘氨酸G突变为谷氨酸E，以G184E表示；
[0044](3)第223位脯氨酸P突变为甘氨酸G，以P223G表示；
[0045](4)第256位色氨酸W突变为丙氨酸A，以W256A表示；
[0046](5)第260位异亮氨酸I突变为半胱氨酸C，以I260C表示；
[0047](6)第360位天冬酰胺N突变为赖氨酸K，以N360K表示；
[0048](7)第449位半胱氨酸C突变为甘氨酸G，以C449G表示；
[0049](8)第469位组氨酸H突变为苏氨酸T，以H469T表示；
[0050](9)第504位缬氨酸V突变为赖氨酸K，以V504K表示；
[0051](10)第612位甲硫氨酸M突变为苯丙氨酸F，以M612F表示。
[0052]专利技术人发现，在该优选的实施方式下，有利于进一步提高乙酰辅酶A合成酶突变体的催化活性。
[0053]根据本专利技术，根据催化活性的提高，优选地，该乙酰辅酶A合成酶突变体为突变体
ACS H112W、G184E、H469T，更加优选为突变体ACS H469T。
[0054]上述乙酰辅酶A合成酶突变体可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。示例性地，本专利技术中提供的乙酰辅酶A合成酶突变体通过使用定点饱和突变技术对SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的编码基因进本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种耦合机器学习结合机制引导的乙酰辅酶A合成酶突变体，其特征在于，该乙酰辅酶A合成酶突变体为将具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的酶在第112位、第184位、第223位、第256位、第260位、第360位、第449位、第469位、第504位和第612位中的至少一位进行突变。2.根据权利要求1所述的乙酰辅酶A合成酶突变体，其特征在于，该乙酰辅酶A合成酶突变体为将具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的酶进行(1)
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(10)中至少一种所述的突变：(1)第112位组氨酸H突变为色氨酸W；(2)第184位甘氨酸G突变为谷氨酸E；(3)第223位脯氨酸P突变为甘氨酸G；(4)第256位色氨酸W突变为丙氨酸A；(5)第260位异亮氨酸I突变为半胱氨酸C；(6)第360位天冬酰胺N突变为赖氨酸K；(7)第449位半胱氨酸C突变为甘氨酸G；(8)第469位组氨酸H突变为苏氨酸T；(9)第504位缬氨酸V突变为赖氨酸K；(10)第612位甲硫氨酸M突变为苯丙氨酸F。3.根据权利要求2所述的乙酰辅酶A合成酶突变体，其特征在于，该乙酰辅酶A合成酶突变体为将具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的酶进行(8)所述的突变。4.一种编码乙酰辅酶A合成酶突变体的基因，其特征在于，该基因具有编码权利要求1至3中任意一项所述的乙酰辅酶A合成酶突变体的核苷酸序列。5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求4所述的基因；优选地，所述重组载体的表达载体为pET
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32a质粒。6.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求4所述的基...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，施天穹，李安妮，李秀娟，李雅文，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：
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