gb-miR160—GbERF4模块在调控银杏萜内酯合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了gb

【技术实现步骤摘要】
gene clusters modulate biosynthesis of specialized metabolites in plants.Plant Physiol 182(2):840
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856.)。这些结果或许能解释ERF转录因子具有调控萜类化合物合成的保守功能，也为GbERF4作为银杏萜内酯合成的调节因子提供了证据。
[0016]MiR160是一类保守的miRNA，已在拟南芥、番茄、水稻、杨树等多种模式和非模式植物中发现，在植物的各种生物过程中起着至关重要的作用，包括次生代谢产物合成。降解组测序是一种高通量的检测方法，可以有效地全面鉴定miRNA的靶基因。本申请人所在的课题组先前的研究表明miR60与银杏萜内酯生物合成有关(Ye J,Zhang X,Tan J,Xu F,Cheng S,Chen Z,Zhang W,Liao Y(2020)Global identification of Ginkgo biloba microRNAs and insight into their role in metabolism regulatory network of terpene trilactones by high
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throughput sequencing and degradome analysis.Ind Crop Prod 148,112289)，但未见具体的调控作用报道。在这项研究中，我们发现gb
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miR160在萜内酯含量最高的根中表达水平最低，表明gb
‑r/>miR160负向调控萜内酯积累(图8b)。此外，我们利用qRT
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PCR分析了gb
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miR160在银杏不同组织中的表达水平(图7)，这一结果验证了gb
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miR160的真实性。转基因研究结果表明，miR160过表达降低了烟草中萜类化合物的合成(图11a和图6a)。本申请的研究表明银杏Gb
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miR160与其他植物的miR160类似，参与了萜内酯的合成。
[0017]大量研究揭示了TF和miRNA之间普遍存在相互作用，miRNA会影响TFs的转录水平。尽管miR160
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TF模块已被证明对调节植物生长发育多种过程至关重要，但参与植物次生代谢产物合成中的报道较少，尤其对于银杏萜内酯合成的调节机制尚未阐明。先前的研究表明，miR160在不同物种中主要通过靶向ARF家族不同成员参与了植物生长发育过程。本申请鉴定了一个miR160新的靶基因ERF4。我们在烟草叶片中观察到gb
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miR160对GbERF4的靶向切割作用(图9b和d)，同时双荧光素酶基因报告实验也验证了gb
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miR160对GbERF4的抑制作用(图9f)。这些结果为miR160
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ERF调控模块的发现提供了直接的证据。
[0018]在本申请研究中，明确了银杏中miR160—GbERF4模块间的靶向关系，且提供了确凿的证据证明银杏中的miR160
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ERF4模块调控萜内酯的生物合成。通过Y1H和双荧光素酶报告实验发现GbERF4可以与HMGS1、AACT1、DXS1、GGPPS2和LPS2的启动子在体外结合，并在体内激活它们(图11)。先前的研究表明，HMGS、AACT和DXS是萜类化合物合成途径中的关键基因，GGPPS在二萜产物合成中发挥了重要作用，LPS是银杏萜内酯合成的第一个酶基因，这些基因是萜内酯合成途径中的关键基因。因此，我们的研究结果表明GbERF4具有转录激活特异性，能激活多个萜内酯生物合成途径上游结构基因的表达，具有高效地调控银杏萜内酯合成的潜力。先前的多项研究表明MeJA能够诱导银杏萜内酯合成，但其中的原因一直未被揭示。本申请的研究结果从另一方面或许解答了这些疑惑，即GbERF4能够被MeJA诱导表达(图2c)，影响银杏萜内酯的积累。此外，随着基因组、高通量测序等技术的发展，银杏中的基因信息也逐渐清晰，因此还可能有潜在miR160或者GbERF4的靶基因未被鉴定，有待下一步研究。
[0019]综上所述，本申请的研究结果揭示了gb
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miR160
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GbERF4模块参与银杏萜内酯生物合成的分子机制(图12)。gb
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miR160通过靶向剪切GbERF4来抑制GbERF4对银杏萜内酯合成途径中靶基因HMGS1、DXS1、AACT1、GGPPS2和LPS2的激活，进而控制着银杏萜内酯的合成和积累。gb
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miR160
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GbERF4模块同时对萜内酯合成途径中多个基因的调控是罕见且高效的，
具有巨大的应用前景。这些发现拓展了我们对gb
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miR160
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GbERF4模块在银杏萜内酯生物合成调控作用中的理解，并为高萜内酯含量银杏的遗传改良提供了理论基础与技术支撑。
[0020]本专利技术相比现有技术具有以下优点：
[0021]本申请筛选鉴定了一个参与银杏萜内酯生物合成的调控组件gb
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miR160—GbERF4。首先，通过表达模式分析鉴定了参与萜内酯合成的gb
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miR160和GbERF4。转基因实验表明gb
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miR160负向调控萜类化合物合成，GbERF4正向调控萜类化合物合成。降解组、瞬时表达和双荧光素酶报告实验验证了gb
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miR160靶向并切割转录因子GbERF4。进一步的酵母单杂和双荧光素酶报告实验表明GbERF4通过结合HMGS1，AACT1，DXS1，LPS2和GGPPS2启动子并激活它们表达，进而参与了萜内酯的合成。综上所述，本研究揭示了gb
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miR160
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GbERF4模块调控银杏萜内酯合成的分子机制，为阐明银杏萜内酯合成的基因调控网络提供了理论模型，并为利用基因工程手段提高银杏萜内酯含量提供了技术支撑和靶标基因。
附图说明
[0022]图1为GbERF1/2/3/4在不同银杏组织中的表达模式图；
[0023]图2为参与银杏萜内酯生物合成的GbERF4基因筛选及表达模式分析图；
[0024]图3为过表达GbERF4转基因烟草的结果图；
[0025]图4为申请中的凝胶电泳验证图；
[0026]图5为GbERF4和gb
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miR160过表达T1代烟草植株萜类化合物含量测定(a)及萜类合成途径中结构基因的表达水平检测对比图；
[0027]图6为GbERF4和gb
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miR160过表达T0代烟草植株萜类化合物含量测定(a)及萜类合成途径中结构基因的表达水平检测对比图；
[0028]图7为gb
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miR160在不同银杏组织中的表达模式图；
[0029]图8为从34年银杏树上采集的不同组织样品以及本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.gb
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miR160—GbERF4模块在调控银杏萜内酯合成中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括gb
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miR160—GbERF4调控组件的筛选鉴定。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，gb
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miR160负向调控萜类化合物合成，GbERF4正向调控萜类化合物合成。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，GbERF4可与...

【专利技术属性】
技术研发人员：许锋，郑嘉瑞，何筱，周仙，刘晓梦，易雨薇，苏东雪，张威威，廖咏玲，叶家保，王启剑，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：