乳样本中游离水溶性维生素的检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种乳样本中游离水溶性维生素的检测方法及其应用，涉及分析化学技术领域，该检测方法能够检测乳样本中的游离维生素B1、B2、B5和烟酰胺，包括将经过蛋白沉淀处理和脱脂处理后的提取液吹干复溶后进行液相色谱串联质谱检测，将检测值带入标准曲线中得到各维生素的含量。其中脱脂处理包括：(A)弃去蛋白沉淀处理后的上清液上层，取中下层用于后续处理；(B)采用固相萃取法处理蛋白沉淀处理后上清液；和，(C)使用有机相对待测样本脱脂，分离水相用于后续处理中的至少一种。该检测方法具备样品制备简单、检测时间短、灵敏度高、特异性好的优点，缓解了现有技术中存在的乳样本中游离水溶性维生素难以检测的问题。离水溶性维生素难以检测的问题。离水溶性维生素难以检测的问题。

【技术实现步骤摘要】
乳样本中游离水溶性维生素的检测方法及其应用


[0001]本专利技术涉及分析化学
，尤其是涉及一种乳样本中游离水溶性维生素的检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]母乳(Human milk，HM)是婴儿早期的重要营养来源，世界卫生组织要求婴儿生命的前6个月纯母乳喂养。母乳不仅是婴儿生长发育的营养物质，还能够为婴儿提供对抗生命早期的一些免疫疾病的保护作用。母乳中游离B族维生素是母乳的重要营养成分，在婴幼儿生长发育中发挥重要作用。游离维生素B1参与糖代谢和神经传导过程，游离维生素B2参与机体生物氧化，游离烟酰胺参与体内蛋白和糖的代谢，游离维生素B5在生物体内转化为辅酶A(CoA)，是生物体内重要的辅酶因子和蛋白修饰因子。目前研究表明，部分B族维生素如维生素B1和B2属于Ⅰ类营养物质，它们在乳汁中的分泌会因母体耗竭而迅速和/或大幅减少。因而适时准确评估这些化合物在母乳中含量对保证喂养过程中从母乳获取全面充足营养非常重要。
[0003]目前母乳成分分析一般采用母乳分析仪，分析的内容包括脂肪、蛋白质、乳糖、密度、水分、能量、矿物质等，不能对游离B族维生素进行评估。免疫分析法和液相色谱可用于B族维生素的检测，但免疫分析法特异性差，液相色谱则要求目标分析物与干扰物完全分离，样品检测时间长。
[0004]而LC
‑
MS/MS出色的灵敏度、选择性和特异性能使其成为母乳游离B族维生素检测的潜在重要工具。而由于母乳与血浆、血清、尿液等生物体液相比糖和脂类物质含量较高，LC
‑
MS/MS准确检测游离B族维生素也具备一定的挑战。目前多个建立的LC
‑
MS/MS方法存在基质干扰严重、样品制备复杂等问题。因此，改进乳中游离B族维生素是目前有待解决的问题。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的在于提供一种乳样本中游离水溶性维生素的检测方法，以缓解现有技术中存在的乳样本中游离水溶性维生素难以检测的问题。
[0007]本专利技术的第二目的在于提供上述检测方法在在制备乳样本中游离水溶性维生素检测产品中的应用。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：
[0009]根据本专利技术的一个方面，提供了一种乳样本中游离水溶性维生素的检测方法，该检测方法包括将经预处理的待测样本使用液相色谱串联质谱检测，将检测值带入标准曲线中，计算得到待测样本中游离水溶性维生素的含量；
[0010]所述预处理包括蛋白沉淀处理和脱脂处理；所述脱脂处理包括(A)～(C)中的至少一种：
[0011](A)弃去蛋白沉淀处理后的上清液上层，取中下层用于后续处理；
[0012](B)采用固相萃取法处理蛋白沉淀处理后上清液；
[0013](C)使用有机相对待测样本脱脂，分离水相用于后续处理；
[0014]将经过蛋白沉淀处理和脱脂处理后的提取液吹干复溶后进行液相色谱串联质谱检测；
[0015]所述游离水溶性维生素包括维生素B1、维生素B2、烟酰胺和维生素B5。
[0016]优选地，所述脱脂处理选自(A)和/或(B)，所述预处理包括对待测样本进行蛋白沉淀处理，然后进行脱脂处理，获得提取液吹干复溶后进行液相色谱串联质谱检测；
[0017]或，所述脱脂处理选自(C)，所述预处理包括使用有机相对待测样本脱脂，分离水相后进行蛋白沉淀处理，将获得的上清液吹干复溶后进行液相色谱串联质谱检测；
[0018]或，所述脱脂处理包括(C)，还包括(A)和/或(B)：所述预处理包括使用有机相对待测样本脱脂，分离水相后进行蛋白沉淀处理，然后进行脱脂处理(A)和/或(B)，获得提取液吹干复溶后进行液相色谱串联质谱检测。
[0019]优选地，所述上清液上层占所述上清液体积大于10％；
[0020]优选地，所述有机相选自叔丁基甲醚、二氯甲烷或乙醚或其组合；
[0021]优选地，待测样本与所述有机相的体积比为1:0.5～1:3；
[0022]优选地，将待测样本与所述有机相涡旋混匀，分离水相后进行后续处理；
[0023]优选地，将待测样本与所述有机相旋涡混匀2～5min，静置5～10min，然后3000～15000rpm离心5～15min；
[0024]优选地，所述固相萃取法采用反相填料固相萃取柱或固相萃取板进行。
[0025]优选地，所述蛋白沉淀处理包括使用蛋白沉淀剂沉淀蛋白；
[0026]优选地，所述蛋白沉淀剂包括甲醇，所述甲醇的浓度至少为70％v/v；
[0027]优选地，所述蛋白沉淀剂占总体积的50～80％；
[0028]优选地，加入蛋白沉淀剂后旋涡混匀3～5min，12000～15000rpm离心10～15min，获得所述上清液；
[0029]优选地，所述吹干复溶包括氮气吹干并复溶；
[0030]优选地，使用5～10mM甲酸铵水溶液复溶。
[0031]优选地，所述待测样本中加入内标；
[0032]优选地，所述内标包括同位素标记的各分析物；
[0033]优选地，所述内标包括维生素B1
‑
(4
‑
甲基
‑
13
C
‑
噻唑
‑5‑
基
‑
13
C3)、维生素B2
‑
13
C4,
15
N2、烟酰胺
‑
D4和维生素B5
‑
13
C3,
15
N。
[0034]优选地，液相色谱洗脱包括使用流动相A和流动相B洗脱，流动相A为水相，流动相B为有机相；所述流动相A含有2～10mM甲酸铵，所述流动相B含有甲醇或乙腈；
[0035]优选地，所述流动相A为含有2～10mM甲酸铵的水溶液；
[0036]优选地，所述流动相B中甲醇或乙腈的含量至少为70％v/v；
[0037]优选地，所述流动相A为含有5mM甲酸铵的水溶液，流动相B为甲醇；
[0038]优选地，色谱柱选自反相色谱柱；
[0039]优选地，所述反相色谱柱包括C18色谱柱、T3色谱柱或苯基己基色谱柱。
[0040]优选地，液相色谱洗脱程序如下：
[0041]0min，流动相A 90～100％，流动相B 0～10％；2.3min，流动相A 20～30％，流动相B 70～80％；4min，流动相A20～30％，流动相B 70～80％；4.1min，流动相A 90～100％，流动相B 0～10％；5min，流动相A 90～100％，流动相B 0～10％；
[0042]优选地，0min，流动相A 95％，流动相B 5％；2.3min，流动相A 25％，流动相B 75％；4min，流动相A 25％，流动相B 75％；4.1min，流动相A 95％，流动相B 5％；5min，流动本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乳样本中游离水溶性维生素的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括将经预处理的待测样本使用液相色谱串联质谱检测，将检测值带入标准曲线中，计算得到待测样本中游离水溶性维生素的含量；所述预处理包括蛋白沉淀处理和脱脂处理；所述脱脂处理包括(A)～(C)中的至少一种：(A)弃去蛋白沉淀处理后的上清液上层，取中下层用于后续处理；(B)采用固相萃取法处理蛋白沉淀处理后上清液；(C)使用有机相对待测样本脱脂，分离水相用于后续处理；将经过蛋白沉淀处理和脱脂处理后的提取液吹干复溶后进行液相色谱串联质谱检测；所述游离水溶性维生素包括维生素B1、维生素B2、烟酰胺和维生素B5。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述脱脂处理选自(A)和/或(B)，所述预处理包括对待测样本进行蛋白沉淀处理，然后进行脱脂处理，获得提取液吹干复溶后进行液相色谱串联质谱检测；或，所述脱脂处理选自(C)，所述预处理包括使用有机相对待测样本脱脂，分离水相后进行蛋白沉淀处理，将获得的上清液吹干复溶后进行液相色谱串联质谱检测；或，所述脱脂处理包括(C)，还包括(A)和/或(B)：所述预处理包括使用有机相对待测样本脱脂，分离水相后进行蛋白沉淀处理，然后进行脱脂处理(A)和/或(B)，获得提取液吹干复溶后进行液相色谱串联质谱检测。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述上清液上层占所述上清液体积大于10％；优选地，所述有机相选自叔丁基甲醚、二氯甲烷或乙醚或其组合；优选地，待测样本与所述有机相的体积比为1:0.5～1:3；优选地，将待测样本与所述有机相涡旋混匀，分离水相后进行后续处理；优选地，将待测样本与所述有机相旋涡混匀2～5min，静置5～10min，然后3000～15000rpm离心5～15min；优选地，所述固相萃取法采用反相填料固相萃取柱或固相萃取板进行。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白沉淀处理包括使用蛋白沉淀剂沉淀蛋白；优选地，所述蛋白沉淀剂包括甲醇，所述甲醇的浓度至少为70％v/v；优选地，所述蛋白沉淀剂占总体积的50～80％；优选地，加入蛋白沉淀剂后旋涡混匀3～5min，12000～15000rpm离心10～15min，获得所述上清液；优选地，所述吹干复溶包括氮气吹干并复溶；优选地，使用5～10mM甲酸铵水溶液复溶。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测样本中加入内标；优选地，所述内标包括同位素标记的各分析物；优选地，所述内标包括维生素B1
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(4
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甲基
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C
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噻唑
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基
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C3)、维生素B2
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C4,
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N2、烟酰胺
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D4和维生素B5
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C3,
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【专利技术属性】
技术研发人员：周立，孙敬茹，邵立军，刘胜敏，栗琳，丁亮，
申请(专利权)人：北京豪思医学检验实验室有限公司江苏豪思生物科技有限公司湖南豪思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：