一种利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核酸链的方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核酸链的方法及其应用。该方法为将模板链、上游结合链和下游结合链与聚合酶反应缓冲液充分混合得到混合液Ⅰ、变性后，退火；加入非天然核苷三磷酸和DNA聚合酶，得到混合液Ⅱ，孵育，孵育结束后热处理变性聚合酶；将反应液纯化，得到中间混合产物A；将中间混合产物A与ATP、DNA连接酶混合在反应体系中，得到混合液Ⅲ，孵育后纯化，得到中间混合产物B；将中间混合产物B和亲和纯化磁珠混合在缓冲液中；将混合液用缓冲液多次洗涤，并用碱处理分离模板链，得到混合液Ⅳ；洗涤混合液Ⅳ后，加甲酰胺热孵育磁珠，得到混合液

【技术实现步骤摘要】
一种利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核酸链的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核酸链的方法及其应用。

技术介绍

[0002]非天然碱基(对)的开发在生物化学及生物技术的研究中具有重要作用，是合成生物学的最前沿研究领域。基于非天然碱基来设计合成具有新颖功能的生物大分子元件，既可发挥类似于天然碱基的功能，同时又正交于ATCG体系。新碱基的引入可以丰富有限的DNA、RNA组成元件，极大地拓展遗传密码的数量，并以此为基础合成自然界没有且难以人工合成的催化剂、药物、疫苗及其他产品。在体外，非天然碱基还扩展到了核酸检测诊断技术开发、六碱基核酸适配体筛选、新型生物材料构建等应用领域。另外，在DNA数据存储和计算领域，非天然碱基的引入可将原有ATCG的四进制提升为更高进制，极大地提高DNA数据存储系统的存储能力和DNA计算机运算能力。
[0003]经过多年的发展，一系列具有优良性质的非天然碱基(对)被开发出来，其中最具有代表性的包括：Benner研究组开发的基于氢键作用的dS
‑
dB、dP
‑
dZ碱基对；Hirao研究组开发的基于疏水相互作用的Ds
‑
Px碱基对；Romesberg研究组开发的基于疏水相互作用的dTPT3
‑
dNaM碱基对等等。但目前成功应用于活细胞的复制、转录和翻译全部过程的非天然碱基只有dTPT3
‑
dNaM系列碱基对。
[0004]合成生物学前沿领域的研究对含非天然碱基的引物获取、基因合成、定点突变、SELEX核酸文库构建不可或缺。含非天然碱基的预定义核酸链可以通过化学固相合成或酶法合成进行制备。化学合成以含非天然碱基的亚磷酰胺为原料，而亚磷酰胺非常不稳定，启用后会很快失效。每次启用固相合成需要一次制备大量的(几十上百条)链，不易随时实现少量规模含非天然碱基寡聚核苷酸的制备需求，固相合成需要额外制备昂贵的非天然碱基亚磷酰胺，对于一些碱基带修饰的官能团兼容性差，需要额外的保护、脱保护、后续修饰步骤。相比之下，酶促法仅使用扩增所需的非天然碱基的三磷酸形式即可，三磷酸形式的固体和水溶液均可在低温长时间保存，随时满足对预定义非天然DNA链的获取需求且不受合成数目的限制。且对于一些特殊用途的碱基，酶法兼容性更强。
[0005]对于从头设计的非天然碱基而言，其匹配规则正交于ATCG天然配对模式。并且复制和转录对聚合酶有特别的活性要求。在酶识别底物方面，得益于前人在非天然碱基开发和六碱基DNA/RNA研究领域中的贡献，发现Klenow Fragment(KF)聚合酶、Taq DNA聚合酶、Vent、Deep Vent、KOD、Phusion等DNA聚合酶及其突变株对非天然碱基核苷酸表现出不同程度的识别和合成活性。前人的研究是基于含有非天然碱基核苷酸残基作为模板的条件下，遵循“形状互补”和“堆积”匹配模式将非天然碱基核苷酸通过5
’
端高保真的引入对位。
[0006]我们开发了一种在无非天然模板存在条件下，从头获取含非天然碱基核酸链的酶促方法。利用聚合酶对非天然底物的识别活性，探寻不同聚合酶对非天然碱基与天然碱基
的错配活性和错配规律，在寡聚核苷酸链中部任意预定位置插入非天然碱基。核酸链中部插入非天然碱基后，优化连接酶的活性来修复非天然碱基与天然碱基之间的磷酸骨架。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种使用DNA聚合酶、DNA连接酶高效合成在核酸链特定位点嵌入含非天然核苷酸的预定义寡核酸链的方法。
[0008]本专利技术利用DNA聚合酶将含非天然碱基的核苷酸嵌入DNA双链内部缺口处，再利用DNA连接酶的部分活性完成缺口修复，并进一步获取在特定位点含有非天然碱基(Unnatural base,UB)的预定义寡聚核酸链。经纯化后的寡聚核酸链可应用于核酸分子的特定标记与偶联、含非天然碱基的人工半合成生命的构建等领域。
[0009]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0010](1)将模板链、上游结合链、下游结合链与聚合酶反应缓冲液充分混合得到混合液Ⅰ；
[0011](2)混合液Ⅰ在95℃条件下变性后，退火；
[0012](3)加入非天然核苷三磷酸和聚合酶到退火后的体系中，得到混合液Ⅱ；
[0013](4)将混合液Ⅱ孵育，孵育结束后热处理变性聚合酶；
[0014](5)将(4)中反应液纯化，得到中间混合产物A：带缺口的双链DNA；
[0015](6)将中间混合产物A与ATP、连接酶混合在反应体系中反应，得到混合液Ⅲ；
[0016](7)混合液Ⅲ孵育后纯化，得到中间混合产物B；
[0017](8)将(7)的中间混合产物B和亲和纯化磁珠混合在1
×
BWBS缓冲液中；
[0018](9)将(8)中混合液用1
×
BWBS缓冲液多次洗涤，并用碱处理分离单链产物，得到混合液Ⅳ；
[0019](10)用1
×
BWBS缓冲液多次洗涤混合液Ⅳ后，加甲酰胺热孵育磁珠，得到混合液
Ⅴ
；
[0020](11)纯化混合液
Ⅴ
，即可得到终产物C：含有非天然碱基的ssDNA。
[0021]进一步的，步骤(1)中所述单链终浓度为0.1
‑
10μM；聚合酶反应缓冲液醋酸镁5
‑
15mM，氯化钾10
‑
100mM，Tris
·
HCl10
‑
50mM；反应缓冲液的pH为7.5
‑
7.9。
[0022]进一步的，步骤(1)中所述模板链为预定义链的互补链；非天然核苷酸嵌入位点的对位可以是ATCG中的一种。
[0023]进一步的，步骤(3)中所述聚合酶为KF(exo
‑
)DNA聚合酶、T4(exo
‑
)DNA聚合酶，终浓度为0.02
‑
7U/μL。
[0024]进一步的，步骤(3)中所述非天然核苷酸终浓度为0.5
‑
200μM。
[0025]进一步的，步骤(4)中孵育温度为16～72℃；热变性温度大于90℃；热变性时间大于5min。
[0026]进一步的，步骤(6)中ATP终浓度为0.1
‑
5mM；DNA连接酶终浓度为0.1
‑
20U/μL。
[0027]进一步的，步骤(7)中，孵育温度在16～42℃，孵育产物通过商业化试剂盒、变性或非变性丙烯酰胺胶分离纯化。
[0028]进一步的，步骤(7)1
×
BWBS缓冲液含TrisHCl0
‑
20mM，EDTA1
‑
10mM，氯化钠1
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核苷酸链的方法，其特征包括如下步骤：(1)将单链与聚合酶反应缓冲液充分混合得到混合液Ⅰ；所述单链包括模板链、上游结合链和下游结合链；(2)混合液Ⅰ变性后，退火冷却至室温；(3)加入非天然核苷三磷酸和DNA聚合酶到退火后的体系中，得到混合液Ⅱ；(4)将混合液Ⅱ孵育，孵育结束后热处理变性DNA聚合酶，得到反应液；(5)将步骤(4)中得到的反应液进行纯化，得到中间混合产物A，即插入非天然碱基并带缺口的双链DNA；(6)将中间混合产物A与ATP、DNA连接酶混合在1
×
Tris反应缓冲液体系中，得到混合液Ⅲ；(7)混合液Ⅲ孵育后纯化，得到中间混合产物B，即含非天然碱基的DNA链；(8)将步骤(7)的中间混合产物B和亲和纯化磁珠混合在1
×
BWBS缓冲液中；(9)将步骤(8)中混合液用1
×
BWBS缓冲液多次洗涤，并用碱处理分离DNA模板链，得到混合液Ⅳ；(10)用1
×
BWBS缓冲液多次洗涤混合液Ⅳ后，加甲酰胺热孵育磁珠，得到混合液
Ⅴ
；(11)纯化混合液
Ⅴ
，即可得到终产物C：含有非天然碱基的单链DNA。2.根据权利要求1所述利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核苷酸链的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述单链终浓度为0.1
‑
10μM；聚合酶反应缓冲液中包括醋酸镁5
‑
15mM，氯化钾10
‑
100mM和Tris
·
HCl 10
‑
50mM；反应缓冲液的pH为7.5
‑
7.9；所述模板链为预定义链的互补链。3.根据权利要求1所述利用DNA聚合酶和DNA连接酶便捷制备含非天然碱基核苷酸链的方法，其特征在于，步骤(2)具体为：混合液Ⅰ在95℃条件下变性后...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈庭坚，白静思，邹金容，曹懿君，吴静，郑鑫倩，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：