本发明专利技术公开了一种用于快速检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法，属于兽药残留的免疫化学速测技术领域。本发明专利技术的试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和ＰＶＣ背衬，其特征在于，在ＰＶＣ背衬上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有所述的抗洛克沙砷单克隆抗体－胶体金标记物，该单克隆抗体由杂交瘤细胞系所分泌得到的。所述的硝酸纤维素膜上分别包被有洛克沙砷－载体蛋白偶联物构成的检测线和兔抗鼠ＩｇＧ构成的质控线。本发明专利技术的试纸条有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测快速、准确等显著优点。
【技术实现步骤摘要】
专利说明本专利技术是这样实现的 为了实现本专利技术，申请人制备了一种能分泌抗洛克沙砷的单克隆抗体杂交瘤细胞系。 —种适用于检测洛克沙砷残留的试纸条，它包括样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)和PVC背衬(7)，其特征在于，在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(D、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4);所述的结合垫(2)上包被有所述的抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有洛克沙砷-载体蛋白偶联物构成检测线(5)和兔抗鼠IgG构成质控线(6)。 —种适用于检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条的制备方法，其步骤包括 1)将洛克沙砷与载体蛋白偶联，形成洛克沙砷-载体蛋白偶联物； 2)用洛克沙砷-载体蛋白偶联物(人血清白蛋白)免疫小鼠，分离脾细胞，体外进行细胞融合，筛选后得到分泌抗洛克沙砷的单克隆抗体的细胞系； 3)提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗体； 4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金； 5)将步骤2)制备的抗洛克沙砷单克隆抗体加入步骤3)制备的胶体金中，得到抗洛克沙砷单克隆抗体_胶体金标记物； 6)将抗洛克沙砷单克隆抗体_胶体金标记物包被在结合垫(2)上； 7)将洛克沙砷-载体蛋白偶联物(卵清蛋白)包被在硝酸纤维素膜(3)上构成检测线(5);并将制备的兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜(3)上构成质控线(6); 8)在所述的PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)，得到所述的检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条。 本专利技术选用洛克沙砷-载体蛋白偶联物作为检测线，抗洛克沙砷特异性单克隆抗体为胶体金标记的抗体，利用竞争法来检测待测样品中是否含有洛克沙砷。通过待测样品中的洛克沙砷与包被于硝酸纤维素膜上的洛克沙砷-载体蛋白偶联物共同竞争抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物，在检测线上出现颜色深浅不同的红色条带或不出现条带，质控线处出现红色条带。若待测样品试纸条检测线颜色明显浅于阴性标准品试纸条检测线颜色，同时质控线上出现红色条带则判断为阳性样品，即待测样品中洛克沙砷的浓度在100ppb-500ppb范围内；若待测样品试纸条检测线无颜色出现，同时质控线上出现红色条带也判为阳性样品，即待测样品中洛克沙砷的浓度高于500ppb ;若待测样品试纸条检测线颜色等于或深于阴性标准品试纸条检测线颜色，同时质控线上出现红色条带则判为阴性样品，即洛克沙砷的浓度小于100ppb ;如果质控线上没有红色条带出现，即该试纸条无效。 本检测试纸条(结构图如图2所示)由样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)按顺序依次粘附在PVC背衬(7)上组装而成的。结合垫上包被有本专利技术制备的抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被有检测线(5)和质控线(6)，其中检测线为本专利技术制备的洛克沙砷-载体蛋白(卵清蛋白)偶联物，质控线为本专利技术制备的兔抗鼠IgG。所述的样品垫、结合垫(均购自上海金标公司)、硝酸纤维素膜(购自S&S公司)、吸水垫(购自Whatman公司)、PVC背衬(购自上海金标公司)，所述的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒购自Sigma公司。 与现有技术相比，本专利技术具有以下突出的优点 1、本专利技术的检测洛克沙砷的免疫胶体金试纸条具有特异性强，灵敏度高，检测时 间短(8分钟)等优点。 2、本专利技术的检测试纸条不需要任何特殊仪器、设备，检测成本低。 3、本专利技术的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。 4、本专利技术的检测试纸条储存方便，对温度要求不高，室温下可保存6个月，4-8t: 保存，有效期12个月。附图说明 图1 :本专利技术的总体技术路线图 图2 :本专利技术检测试纸条的组装示意图 图3 :本专利技术检测试纸条结果判定示意图 图中A :为阴性标准品结果，B :为阴性样品结果，C :为阳性样品结果，D、E :为试纸条失效。具体实施例方式实施例1 (制备实施例) 检测洛克沙砷的免疫试纸条的制备方法 1、洛克沙砷_载体蛋白偶联物的制备 合成洛克沙砷_载体蛋白偶联物 (1)合成R0X-HSA全抗原，具体步骤如下首先取20mg ROX加到300 iU 二甲基甲 酰胺溶液中，再缓慢加到lml 0. 5mol/LH2S04中，然后在磁力搅拌下将lml lmol/L NaN02缓 慢加到SMZ溶液中，反应10min，形成重氮盐。 (2)磁力搅拌下，分别取100mg HSA和100mg 0VA各加到4ml磷酸缓冲液中。 (3)将上述形成的重氮化盐溶液在磁力搅拌下缓慢加到HSA溶液和0VA溶液中，用 1MNa0H将pH维持在8-10， 4。C反应lh。 (4)将反应液放在生理盐水中透析3d，每天更换2次生理盐水，以除去未反应的小 分子物质及SMZ等。 (5)将SMZ-HSA和SMZ-0VA溶液分成两部分， 一部分于4。C下保存供紫外和液相测试用，另一部分于-20°C下保存。 2、抗洛克沙砷单克隆抗体的制备 (1)免疫利用申请人所制备的洛克沙砷-人血清白蛋白(HSA)偶联物免疫Balb/ C小鼠(购自中国军事科学院实验动物中心)，免试程序是选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠4 只，体重18-22g，取免疫抗原100mg(以蛋白含量计算)，加等体积完全弗氏佐剂乳化，用注 射器在安培瓶中反复抽吸搅拌，直至乳化药液在水中呈不溶液滴(水包油状态)。于Balb/C 小鼠颈背部皮下多点注射进行一免，每只小鼠0. 5ml ;间隔两周后，抗原量减半用弗氏不完 全佐剂混合，方法同上，进行第二次免疫，再过两周后，进行第三次免疫，方法同前次。三免 后10d免疫鼠尾静脉采血，通过间接ELISA方法测定免疫鼠血清抗体效价。选择抗体效价 较高者用于细胞融合，融合前二天给小鼠脾内注射含30ii g免疫抗原水剂进行加强免疫。 (2)单抗制备免疫鼠眼眶取血后，脊椎脱臼处死，消毒后置于超净工作台上的消5毒表面皿中，小心取出经免疫已肿大的脾脏，用DMEM培养基冲洗2次，每次3ml。经计数细 胞共有5. 6Xl()8个，在37t:水浴中，将SP2/0细胞(购自GBIC0公司)和脾细胞按10 : 1 比例混合于50ml离心管中，轻轻搅匀，1000rpm离心5min，弃上清，弹击管底使细胞混匀成 糊状。将离心管置于37t:水浴中，吸管吸取37t:预热的0. 8ml 50% PEG1500(购自Sigma 公司)，将吸管插入离心管的底部，左手慢慢旋管，右手边搅边加，lmin内加完，将融合液缓 缓吸入吸管中，保持0.5min，然后慢慢放出，lmin内完全放出，并于离心管中静置lmin。静 置之后，立即沿管壁滴加5ml IDMEM不完全培养基(配方DMEM(袋装)13. 5g，青霉素钠(注 射用)10万单位，硫酸链霉素(注射用)10万单位，NaHC03 3. 7g，用重蒸水稀释至1000ml， 并用O. lmol/L NaOH或HCl调节pH为7. 4)终止融合反应，边加边缓慢搅拌，前0. 5min加入 2ml，后0. 5min加入3ml，然后在lmin内加完5ml。补加IDMEM培养基至40ml， 1000rpm离 心5min，弃上本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适用于检测洛克沙砷残留的试纸条，它包括样品垫（１）、结合垫（２）、硝酸纤维素膜（３）、吸水垫（４）和ＰＶＣ背衬（７），其特征在于，在ＰＶＣ背衬（７）上按顺序依次粘附有样品垫（１）、结合垫（２）、硝酸纤维素膜（３）、吸水垫（４）；所述的结合垫（２）上包被有所述的抗洛克沙砷单克隆抗体－胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜（３）上分别包被有洛克沙砷－载体蛋白偶联物构成的检测线（５）和兔抗鼠ＩｇＧ构成的质控线（６）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘汉石，
申请(专利权)人：大连普瑞康生物技术有限公司，王典仁，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]
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