四价FZD和WNT共受体结合抗体分子及其用途制造技术

本文描述了激活Wnt

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】四价FZD和WNT共受体结合抗体分子及其用途
[0001]序列表
[0002]本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式通过电子方式提交，并通过引用将其整体并入。所述ASCII拷贝创建于2021年12月16日，名为117946_PD606WO_FINAL.txt，大小为989,432字节。

技术介绍

[0003]Wnt信号通路对于胚胎发育和成体组织稳态至关重要。当细胞表面膜上的卷曲蛋白受体(FZD)与Wnt配体结合时，Wnt信号传导被启动。Wnt配体是调节各种细胞过程(例如增殖、分化、存活和迁移)的分泌的生长因子。
[0004]人体中存在的19种Wnt配体与由10种卷曲蛋白细胞表面受体(FZD)和几种共受体之一组成的网络相互作用，所述几种共受体引导不同胞内信号传导分支的选择性参与(Wodarz,A.和Nusse,R.Annu.Rev.Cell Dev.Biol.14,59
‑
88(1998)；Angers,S和Moon,R.T.,transduction.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.10,468
‑
477(2009))。FZD具有保守的结构特征(包括七个疏水性跨膜结构域和富含半胱氨酸的配体结合结构域)。已知FZD在三个不同的信号通路(称为Wnt平面细胞极性(PCP)通路、经典Wnt/β
‑
连环蛋白通路和Wnt/钙通路)中发挥作用。Wnt共受体也是指导上述胞内信号级联的差异性参与所必需的。例如，Wnt配体与卷曲蛋白受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6(LRP5/6)共受体家族的成员结合以激活Wnt/β
‑
连环蛋白通路，或与受体酪氨酸激酶样孤儿受体1和2(ROR1/2)(与受体酪氨酸激酶(RYK)或蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)共受体相关)结合以激活替代性的不依赖β
‑
连环蛋白的信号通路。
[0005]Wnt配体对于控制组织干细胞的自我更新和调节许多祖细胞群具有普遍重要的作用，但Wnt蛋白的疏水性和敏感的三级结构使它们的生化纯化具有挑战性，并且使它们在体外和体内的使用效率低下。本文描述了激活Wnt信号通路的四价结合抗体分子和它们的应用方法。

技术实现思路

[0006]本文描述了激活Wnt信号通路的四价结合抗体分子和它们的应用方法。四价结合抗体分子与FZD受体(例如卷曲蛋白类受体1(FZD1)、卷曲蛋白类受体2(FZD2)、卷曲蛋白类受体3(FZD3)、卷曲蛋白类受体4(FZD4)、卷曲蛋白类受体5(FZD5)、卷曲蛋白类受体6(FZD6)、卷曲蛋白类受体7(FZD7)、卷曲蛋白类受体8(FZD8)、卷曲蛋白类受体9(FZD9)或卷曲蛋白类受体10(FZD10))和Wnt共受体(例如LRP5或LRP6(LRP5/6))结合，从而激活Wnt信号通路。在一个实施方式中，四价结合抗体分子与FZD4受体和LRP5和/或LRP6结合并激活Wnt/β
‑
连环蛋白信号通路。本专利技术的四价结合抗体分子在本文中也被称为“FZD激动剂”、卷曲蛋白(Frizzled)和LRP5/6激动剂(Agonist)(FLAg)，在一些实施方式中被称为“ANT”。
[0007]四价结合抗体分子包含：由CH2和CH3结构域组成的Fc结构域或Fc结构域的包含CH3结构域的片段、与一种以上FZD受体(例如FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、
FZD8、FZD9和FZD10中的一种以上)相互作用的第一二价结合结构域，以及与WNT共受体(例如LRP5或LRP6)结合的第二二价结合结构域；其中，FZD结合结构域与Fc结构域的一个末端连接，共受体结合结构域与Fc结构域的另一末端连接。因此，FZD受体的结合结构域不与WNT共受体的结合结构域直接连接，而是它们被Fc结构域或Fc结构域的包含CH3结构域的片段隔开。
[0008]FZD激动剂的Fc结构域可以为具有或不具有效应子功能的免疫球蛋白的Fc结构域。免疫球蛋白可以为IgG(例如IgG1)。在本专利技术的一个实施方式中，四价结合抗体分子包含含有Fc区的两个多肽，其通过每个多肽中Fc区的内在二聚化能力或通过Fc内的杵臼(knob
‑
in
‑
hole)构造二聚化。因此，Fc二聚体可以是异二聚体或同二聚体。通过杵臼构造使肽二聚化的方法描述于WO2018/026942(专利技术人Van Dyk等)、“Carter P.(2001)J.Immunol.Methods 248,7
‑
15”、“Ridgway等，(1996)Protein Eng.9,617
‑
621”、“Merchant等，(1998)Nat.Biotechnol.16,677
‑
681”，以及“Atwell等，(1997)J.Mol.Biol.270,26
‑
35”，全部通过引用并入本文。
[0009]在一个实施方式中，本文所述的FZD激动剂的每个结合结构域是二价的，每个结合结构域可以是单特异性的(具有针对FZD受体(例如FZD4)或Wnt共受体(例如LRP5/6)的相同表位的两个结合位点)，或者可以是双特异性的(具有两个结合位点，每个位点结合FZD或Wnt共受体上的不同表位，例如，LRP5/6共受体内的Wnt1结合位点(LRP5/6的胞外结构域内的结构域E1
‑
E2)和Wnt3结合位点(LRP5/6的胞外结构域内的结构域E3
‑
E4))。在一个实施方式中，LRP5/6结合结构域结合LRP5上的Wnt3A位点(结构域E3
‑
E4)和LRP6上的Wnt3A位点(结构域E3
‑
E4)。
[0010]在本专利技术的实施方式中，与FZD激动剂的Fc结构域连接的FZD结合结构域包含结合FZD(例如FZD4)的一个以上免疫球蛋白重链可变结构域(VH)片段和/或一个以上免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)片段。在本专利技术的一个实施方式中，FZD结合结构域可以包含结合FZD上的相同或不同表位的Fab、双抗体(diabody)或单链可变片段(scFv)、单域抗体片段(例如V
H
H)或它们的组合。
[0011]在本专利技术的一个实施方式中，FZD结合结构域的VH和/或VL结合FZD4或FZD5，并包含表1、表2或表6的FZD4或FZD5结合抗体的轻链CDR和重链CDR，和/或包含与表1、表2或表6的FZD4抗体的CDR具有50％、55％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性、并且仍然保留与FZD4或FZD5受体的结合性的轻链CDR和重链CDR。例如，在本专利技术的一个实施方式中，FZD结合结构域可以包含第一重链(CDR
‑
H1)、第二重链(CDR
‑
H2)和/或第三重链(CDR
‑
H3)，以及第一轻链(CDR
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种四价结合抗体分子，所述四价结合抗体分子包含：(a)包含重链恒定结构域3(CH3)的Fc结构域或Fc结构域的片段；(b)二价低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)结合结构域；和(c)二价卷曲蛋白(FZD)结合结构域；其中，所述LRP5结合结构域与所述Fc结构域的一个末端连接，所述FZD结合结构域与所述Fc结构域的另一个末端连接；其中，所述LRP5结合结构域包含结合LRP5的双抗体，所述FZD结合结构域包含结合FZD4的两个scFv或两个Fab。2.根据权利要求1所述的四价结合抗体分子，其中，(a)所述LRP5结合结构域的双抗体与所述Fc结构域的N末端连接；以及(b)所述FZD4结合结构域与所述Fc结构域的C末端连接。3.根据权利要求2所述的四价结合抗体分子，其中，(a)所述LRP5结合结构域的双抗体通过双抗体的VL或VH与所述Fc结构域的N末端连接；以及(b)所述FZD结合结构域包含与Fc的C末端融合的两个FZD结合Fab，其中，每个Fab通过与所述Fc结构域的CH3结构域连接的Fab的重链可变结构域或轻链可变结构域(VH或VL)与Fc结构域连接。4.一种四价结合抗体分子，所述四价结合抗体分子包含N末端LRP5结合双抗体和包含两个FZD4结合scFv的C末端结构域，所述四价结合抗体分子包含：第一单体和第二单体的二聚体，其中，每个单体包含单链多肽，所述单链多肽从N末端到C末端包含：(a)第一肽，所述第一肽包含结合LRP5的第一重链可变结构域(VH)和第一轻链可变结构域(VL)；(b)包含重链恒定结构域3(CH3)的Fc区或Fc区的片段；和(c)第二肽，所述第二肽包含结合FZD4的第二VL和第二VH；以及第一轻链单体和第二轻链单体，每个轻链单体从N末端到C末端包含与轻链恒定结构域1(CL1结构域)连接的结合FZD4的VL；其中，第一单体和第二单体通过Fc区或Fc区的片段二聚化，每个单体的第一VH和VL与另一个单体的第一VH和VL配对，形成结合LRP5的双抗体，并且每个单体的第二VL和VH配对形成结合FZD4的scFv；并且其中，LRP5结合双抗体形成四价结合抗体分子的N末端LRP5结合结构域，两个FZD4结合scFv形成四价结合抗体分子的C末端FZD结合结构域。5.根据权利要求1所述的四价结合抗体分子，其中，所述FZD结合结构域与所述Fc结构域的N末端连接，所述LRP5结合结构域与所述Fc结构域的C末端连接。6.根据权利要求5所述的四价结合抗体分子，其中，(a)所述FZD结合结构域包含结合FZD4的两个Fab，其中，每个Fab通过与所述Fc结构域的CH2结构域连接的Fab的重链可变结构域或轻链可变结构域(VH或VL)与所述Fc结构域的N末端连接；以及(b)所述LRP5结合结构域包含结合LRP5的双抗体或两个scFv，其中，所述双抗体或两个
scFv通过与所述Fc结构域的CH3连接的双抗体或scFv的VL或VH与Fc结构域的C末端连接。7.一种四价结合抗体分子，所述四价结合抗体分子包含：包含重链恒定结构域3(CH3)的Fc结构域或Fc结构域的片段、包含两个FZD4结合Fab的N末端FZD4结合结构域和包含LRP5结合双抗体的C末端LRP5结合结构域，所述四价结合抗体分子包含：(a)第一重链单体和第二重链单体，其中，每个重链单体包含单链多肽，所述单链多肽从N末端到C末端包含：(i)结合FZD4的重链可变结构域(VH)，其连接至如下(ii)；(ii)重链恒定区结构域1(CH1结构域)，其连接至如下(iii)；(iii)Fc区的CH2结构域，其连接至如下(iv)；(iv)包含结合LRP5共受体的VH的肽，所述结合LRP5共受体的VH与结合LRP5共受体的轻链可变结构域(VL)连接；以及(b)第一轻链单体和第二轻链单体，每个轻链单体从N末端到C末端包含结合FZD4的VL，所述结合FZD4的VL与轻链恒定结构域1(CL1结构域)连接；其中，第一重链单体和第二重链单体通过它们的Fc区或Fc区的片段二聚化；其中，结合LRP5的VH和VL之间的接头的长度促进第一重链单体的VH和VL与第二重链单体的VL和VH配对，从而形成LRP5共受体结合双抗体，FZD结合Fab通过如下形成：每个重链单体与轻链单体配对使得每个重链单体中的结合FZD4的VH和CH1与轻链单体中的结合FZD4的VL和CL1配对；并且其中，Fab在Fc结构域的N末端形成FZD4结合结构域，双抗体在Fc结构域的C末端形成LRP5共受体结合结构域。8.根据权利要求1至7中任一项所述的四价结合抗体分子，其中，所述LRP5结合双抗体是与LRP5共受体胞外结构域内的两个表位结合的二价双特异性LRP5结合结构域。9.根据权利要求8所述的四价结合抗体分子，其中，所述LPR5结合结构域与LRP5共受体的Wnt1表位和Wnt3表位相互作用。10.根据权利要求1至9中任一项所述的四价结合抗体分子，其中，所述FZD结合结构域是单特异性的。11.根据权利要求1至10中任一项所述的四价结合抗体分子，其中，所述LRP5结合结构域的双抗体结合LRP5，所述LRP5结合结构域的双抗体包含表3或表6A中的序列中所示的抗体的重链互补决定区CDR
‑
H1、CDR
‑
H2和CDR
‑
H3以及轻链互补决定区CDR
‑
L1、CDR
‑
L2和CDR
‑
L3。12.根据权利要求1至11中任一项所述的四价结合抗体分子，其中，所述Fc结构域或Fc结构域的片段通过Fc区或Fc区的片段的杵臼构造二聚化。13.根据权利要求12所述的四价结合抗体分子，其中，根据EU编号，所述第一重链单体的Fc区包含突变T366S、L368A和Y407V，所述第二重链单体的Fc区包含突变T366W。14.根据权利要求13所述的四价结合抗体分子，其中，根据EU编号，所述第一重链单体的Fc区还包含突变S354I和E357L，所述第二重链单体的Fc区还包含突变Q347M、Y349F、T350D和L368M。15.根据权利要求13所述的四价结合抗体分子，其中，在第一重链单体和第二重链单体的Fe区之间引入另外的二硫键；优选地，根据EU编号，第一重链单体包含突变Y349C并且第
二重链单体包含突变S354C。16.根据权利要求1至15中任一项所述的四价结合抗体分子，其中，所述Fc结构域缺乏一种以上效应子功能。17.根据权利要求16所述的四价结合抗体分子，其中，所述Fc区具有因根据EU编号的氨基酸突变N297G(NG)和/或D265A(DA)变体而改变它们的效应子功能的突变。18.根据权利要求16所述的四价结合抗体分子，其中，所述Fc区具有因根据EU编号的氨基酸突变L234A、L235A和/或P331S而改变它们的效应子功能的突变。19.根据权利要求18所述的四价结合抗体分子，其中，所述Fc区具有因氨基酸突变L234A和L235A(LALA)而改变它们的效应子功能的突变。20.根据权利要求19所述的四价结合抗体分子，其中，所述Fc区具有因氨基酸突变L234A、L235A和P331S(LALAPS)而改变它们的效应子功能的突变。21.根据权利要求1至20中任一项所述的四价结合抗体分子，其中，所述LRP5结合结构域和FZD结合结构域各自通过接头与所述Fc结构域连接。22.根据权利要求21所述的四价结合抗体分子，其中，所述接头包含1至100个、1至50个、1至30个、1至25个、1至10个、1至6个氨基酸、1至5个氨基酸或2至4个氨基酸。23.根据权利要求21或22所述的四价结合抗体分子，其中，形成LRP5共受体结合结构域的双抗体通过接头GGGGSGGGGSEPKSSDKTHT(SEQ ID NO：892)与Fc结构域融合。24.根据权利要求21至23中任一项所述的四价结合抗体分子，其中，所述FZD4结合Fab通过接头GGGSGGGSGGGSGGGSGSTG(SEQ ID NO：891)与Fc区融合。25.根据权利要求1至24中任一项所述的四价结合抗体分子，其中，结合LRP5共受体的VH通过短接头GGGGS(SEQ ID NO：886)与结合LRP5共受体的VL连接。26.根据权利要求1至25中任一项所述的四价结合抗体分子，其中，所述FZD结合结构域包含结合FZD4的两个Fab。27.根据权利要求26所述的四价结合抗体分子，其中，所述FZD结合Fab包含表1、表2或表6中的序列中所示的抗体的轻链互补决定区CDR
‑
L1、CDR
‑
L2和CDR
‑
L3以及重链CDR：CDR
‑
H1、CDR
‑
H2和CDR
‑
H3。28.根据权利要求1至4和8至27中任一项所述的四价结合抗体分子，其中，所述四价结合抗体分子包含：(a)第一重链单体和第二重链单体的二聚体，每个单体包含单链多肽，所述单链多肽从N末端到C末端包含：(1)包含结合LRP5的重链可变结构域(VH)和结合LRP5的轻链可变结构域(VL)的肽，(2)包含CH3的Fc区或Fc区的片段，(3)结合FZD4的VH，以及(4)重链恒定结构域1(CH1)，其中：(5)结合LRP5的VH包含表3或表6中的序列中所示的抗体的重链CDR(CDR
‑
H1、CDR
‑
H2和CDR
‑
H3)，(b)结合LRP5的VL包含表3或表6中的序列中所示的抗体的轻链CDR(CDR
‑
L1、CDR
‑
L2和CDR
‑
L3)，
(c)结合FZD4的VH包含表1、表2或表6中的序列中所示的抗体的重链CDR(CDR
‑
H1、CDR
‑
H2和CDR
‑
H3)；以及(d)第三轻链单体和第四轻链单体，所述第三轻链单体和第四轻链单体各自包含结合FZD4的VL和轻链恒定结构域1(CL1)，所述结合FZD4的VL包含表1、表2或表6中的序列中所示的抗体的轻链CDR(CDR
‑
L1、CDR
‑
L2和CDR
‑
L3)，其中，第一重链单体和第二重链单体通过它们的Fc区二聚化，第一单体的结合LRP5的VL和VH与第二单体的结合LRP5的VH和VL配对形成结合LRP5的二价双抗体，并且第三轻链单体和第四轻链单体的CL1和结合FZD4的VL与第一重链单体和第二重链单体的CH1和结合FZD4的VH配对形成结合FZD4的两个Fab，其中，双抗体形成N末端二价LRP5结合结构域，两个Fab形成C末端二价FZD4结合结构域。29.根据权利要求5至7中任一项所述的四价结合抗体分子，其中，所述四价结合抗体分子包含：(a)第一重链单体和第二重链单体的二聚体，每个单体包含单链多肽，所述单链多肽从N末端到C末端包含：(1)结合FZD4的VH，(2)包含CH3的Fc区或Fc区的片段，(3)包含结合LRP5的VH和结合LRP5的VL的肽，以及(4)重链恒定结构域1(CH1)，其中：(5)结合LRP5的VH包含表3或表6中的序列中所示的抗体的重链CDR(CDR
‑
H1、CDR
‑
H2和CDR
‑
H3)，(b)结合LRP5的VL包含表3或表6中的序列中所示的抗体的轻链CDR(CDR
‑
L1、CDR
‑
L2和CDR
‑
L3)，(c)结合FZD4的VH包含表1、表2或表6中的序列中所示的抗体的重链CDR(CDR
‑
H1、CDR
‑
H2和CDR
‑
H3)；以及(d)第三轻链单体和第四轻链单体，所述第三轻链单体和第四轻链单体各自从N末端至C末端包含结合FZD4的VL和轻链恒定结构域1(CL1)，所述结合FZD4的VL包含表1、表2或表6中的序列中所示的抗体的轻链CDR(CDR
‑
L1、CDR
‑
L2和CDR
‑
L3)，其中，第一重链单体和第二重链单体通过它们的Fc区二聚化，第一单体的结合LRP5的VL和VH与第二单体的结合LRP5的VH和VL配对形成结合LRP5的二价双抗体，并且第三轻链单体和第四轻链单体的CL1和结合FZD4的VL与第一重链单体和第二重链单体的CH1和结合FZD4的VH配对形成结合FZD4的两个Fab，其中，双抗体形成C末端二价LRP5结合结构域，两个Fab形成N末端二价FZD4结合结构域。30.根据权利要求28或29所述的四价结合抗体分子，其中，所述LRP5结合双抗体是双特异性的，其中：第一重链单体的结合LRP5的VH的CDR和第二重链单体的结合LRP5的VH的CDR不相同，以及第一重链单体的结合LRP5的VL的CDR和第二重链单体的结合LRP5的VL的CDR不相同。31.根据权利要求30所述的四价结合抗体分子，其中：
在所述第一重链单体中，(a)结合LRP5的VH的CDR
‑
H1和CDR
‑
H2分别包含FSSSSI(SEQ ID NO：528)和SISSSYGYTY(SEQ ID NO：553)，或者，结合LRP5的VH的CDR
‑
H1和CDR
‑
H2分别包含LSYYYM(SEQ ID NO：527)和SIYSSYGYTY(SEQ ID NO：552)，并且(b)结合LRP5的VL的CDR
‑
L2和CDR
‑
L3分别包含SASDLYS(SEQ ID NO：491)和YAGAGLI(SEQ ID NO：510)，或者，结合LRP5的VL的CDR
‑
L2和CDR
‑
L3分别包含SASSLYS(SEQ ID NO：2)和SSYSLI(SEQ ID NO：130)；以及在所述第二重链单体中，(c)结合LRP5的VH的CDR
‑
H1和CDR
‑
H2分别包含FTAYAM(SEQ ID NO：536)和SIYPSGGYTA(SEQ ID NO：566)，或者，结合LRP5的VH的CDR
‑
H1和CDR
‑
H2分别包含FSSSSI(SEQ ID NO：528)和SISSSYGYTY(SEQ ID NO：553)，并且(d)结合LRP5的VL的CDR
‑
L2和CDR
‑
L3分别包含SASSLYS(SEQ ID NO：2)和YWAYYSPI，或者，结合LRP5的VL的CDR
‑
L2和CDR
‑
L3分别包含SASSLYS(SEQ ID NO：2)和ASYAPI。32.根据权利要求28至31中任一项所述的四价结合抗体分子，其中，在所述第一重链单体和第二重链单体中，结合FZD4的VH的CDR
‑
H1和CDR
‑
H2分别包含LSSYSM(SEQ ID NO：24)和YISSYYGYTY(SEQ ID NO：51)，或者，结合FZD4的VH的CDR
‑
H1和CDR
‑
H2分别包含LSSYSM(SEQ ID NO：24)和YISSYDSITD(SEQ ID NO：61)。33.根据权利要求28至32中任一项所述的四价结合抗体分子，其中，在所述第三轻链单体和第四轻链单体中，结合FZD4的VL的CDR
‑
L1和CDR
‑
L2分别包含SVSSA(SEQ ID NO：1)和SASSLYS(SEQ ID NO：2)，结合FZD4的VL的CDR
‑
L3包含WYYAPI(SEQ ID NO：3)或WYNAPI(SEQ ID NO：12)。34.根据权利要求28、29、30、32和33中任一项所述的四价结合抗体分子，所述四价结合抗体分子包含二价双特异性LRP5结合结构域，其中：(a)在所述第一重链单体中，结合LRP
‑
5的VH包含SEQ ID NO：528的CDR
‑
H1、SEQ ID NO：553的CDR
‑
H2和SEQ ID NO：586的CDR
‑
H3，结合LRP
‑
5的VL包含表6A的ANT16
‑
臼的SEQ ID NO：1的CDR
‑
L1、SEQ ID NO：491的CDR
‑
L2和SEQ ID NO：510的CDR
‑
L3，或者结合LRP5的VH包含SEQ ID NO：527的CDR
‑
H1、SEQ ID NO：552的CDR
‑
H2和SEQ ID NO：584的CDR
‑
H3，结合LRP5的VL包含表6A的ANT18
‑
臼的SEQ ID NO：1的CDR
‑
L1、SEQ ID NO：2的CDR
‑
L2和SEQ ID NO：130的CDR
‑
L3，或者结合LRP
‑
5的VH包含SEQ ID NO：527的CDR
‑
H1、SEQ ID NO：552的CDR
‑
H2和SEQ ID NO：584的CDR
‑
H3，结合LRP
‑
5的VL包含表6A的ANT20
‑
臼的SEQ ID NO：1的CDR
‑
L1、SEQ ID NO：491的CDR
‑
L2和SEQ ID NO：510的CDR
‑
L3，或者结合LRP
‑
5的VH包含SEQ ID NO：528的CDR
‑
H1、SEQ ID NO：553的CDR
‑
H2和SEQ ID NO：586的CDR
‑
H3，结合LRP
‑
5的VL包含表6A的ANT21
‑
臼的SEQ ID NO：1的CDR
‑
L1、SEQ ID NO：2的CDR
‑
L2和SEQ ID NO：130的CDR
‑
L3，或者结合LRP
‑
5的VH包含SEQ ID NO：527的CDR
‑
H1、SEQ ID NO：552的CDR
‑
H2和SEQ ID NO：584的CDR
‑
H3，结合LRP
‑
5的VL包含表6A的ANT36
‑
臼的SEQ ID NO：1的CDR
‑
L1、SEQ ID NO：2的CDR
‑
L2和SEQ ID NO：130的CDR
...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：安托拉诊疗公司，
类型：发明
国别省市：