腺相关病毒(AAV)的生产制造技术

本公开涉及在E1互补产生细胞中用于生产腺相关病毒(AAV)的方法。腺相关病毒(AAV)的方法。腺相关病毒(AAV)的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】腺相关病毒(AAV)的生产
[0001]序列表
[0002]本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且在此通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2022年2月7日，命名为0132
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0156WO1_SL.txt，大小为55,665字节。


[0003]本公开涉及用于在E1互补产生细胞中生产腺相关病毒(AAV)的方法。

技术介绍

[0004]腺相关病毒(AAV)是一种无包膜DNA病毒。作为体内基因治疗的主要病毒载体，AAV是非致病性的并可以有效地感染大范围人体组织。AAV基因组包含一个4.7kb的单链DNA，该单链DNA编码两个主要基因：Rep基因编码四种亚型(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)，其支持AAV DNA复制、包装、整合和转录；Cap基因合成三种用于病毒蛋白壳或衣壳的构建的VP蛋白(VP1、VP2和VP3)。
[0005]野生型AAV在没有辅助病毒(如腺病毒(Ad)和单纯疱疹病毒(HSV))的情况下无法复制。腺病毒辅助基因已确定为AAV复制所必需和充分条件，其包含E1A、E1B、E2A、E4和VA。腺病毒5型(Ad5)5'4.3kb基因组DNA已经整合到人胚胎肾293(HEK293)细胞的19号染色体中。此Ad5基因组片段表达所有E1A(例如289R、243R、171R)以及E1B(例如19K和55K)亚型。已经开发了具有E1A和E1B整合的其他细胞系，包含例如PER.C6细胞和细胞。参见例如Fallaux等人，《人类基因疗法(Human Gene Ther)》9(13):1909
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1917(1998)和Schiedner等人，《人类基因疗法》11(15):2105
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2116(2000)。因此，这些细胞已经表达E1A和E1B，从而可以通过“三重质粒转染”方法支持重组AAV(rAAV)的生产，即转染仅编码E2A、E4orf6和VA的辅助质粒(pHelper)，以及编码Rep和Cap基因(pRepCap)和目标基因(pAAV
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GOI)的质粒。这种具有基因组整合的E1A和E1B基因并且天然表达E1A和E1B蛋白的细胞称为“E1互补产生细胞”。
[0006]目前，世界上超过70％的基于AAV的基因治疗管道依赖于通过标准三重质粒转染方法在HEK293细胞中瞬时转染的制造平台。HEK293和其他E1互补产生细胞制造平台的生产率可能无法满足对AAV不断增长的需求，例如用于临床开发和商业化。然而，目前用于增加E1互补产生细胞，如HEK293细胞中AAV生产率的方法(例如高生产细胞克隆筛选和分离、转染方案优化和制造工艺开发)是昂贵且耗时的。

技术实现思路

[0007]在一些实施例中，本公开提供了一种在E1互补产生细胞中生产腺相关病毒(AAV)的方法，其包括：(a)用一种或多种载体转染E1互补产生细胞，所述载体包括：(i)E1A腺病毒辅助基因；(ii)选自E2A、E4或两者的腺病毒辅助基因；(iii)病毒相关的非编码RNA(VA RNA)；和(iv)选自Rep、Cap或两者的AAV基因；(b)在适于生产AAV的条件下培养经转染的E1
互补产生细胞；以及(c)从培养的E1互补产生细胞中纯化AAV，从而获得AAV。
[0008]在另外的实施例中，本公开提供了一种在E1互补产生细胞中生产腺相关病毒(AAV)的方法，其包括：(a)用以下物质转染E1互补产生细胞：(i)包括与第一启动子可操作地连接的E1A的第一载体；(ii)包括E2A、E4和病毒相关的非编码RNA(VA RNA)的第二载体，所述E2A、E4和VARNA全部可操作地连接到第二启动子；和(iii)包括Rep和Cap的第三载体，所述Rep和Cap两者均可操作地连接到第三启动子，其中(i)与(ii)和(iii)中的每一种的转染比为约1:1至约3:1；(b)在适于生产AAV的条件下培养经转染的E1互补产生细胞；以及(c)从培养的E1互补产生细胞中纯化AAV，从而获得AAV。合适地，第一、第二或第三载体中的一种或多种进一步包括选自E1B、NP1、NS2或其组合的辅助基因。合适地，E1B是E1B
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19k或E1B
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55k。合适地，辅助基因包括NP1和NS2的组合。在实施例中，该方法进一步包括用包括GOI的载体转染E1互补产生细胞。
[0009]在进一步的实施例中，本公开提供了一种在E1互补产生细胞中生产腺相关病毒(AAV)的方法，其包括：(a)用以下物质转染E1互补产生细胞：(i)包括与第一启动子和增强子可操作地连接的E1A的第一载体；(ii)包括E2A、E4和病毒相关的非编码RNA(VA RNA)的第二载体，所述E2A、E4和VA RNA全部可操作地连接到第二启动子；和(iii)包括Rep和Cap的第三载体，所述Rep和Cap各自可操作地连接到第三启动子；(b)在适于生产AAV的条件下培养经转染的E1互补产生细胞，其中E1A以与E2A、E4、VA RNA、Rep和Cap中的每一种的约1:1至约3:1的比率表达；以及(c)从培养的E1互补产生细胞中纯化AAV，从而获得AAV。合适地，第一、第二或第三载体中的一种或多种进一步包括选自E1B、NP1、NS2或其组合的辅助基因。合适地，E1B是E1B
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19k或E1B
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55k。合适地，辅助基因包括NP1和NS2的组合。在实施例中，该方法进一步包括用包括GOI的载体转染E1互补产生细胞。
[0010]在又进一步的实施例中，本公开提供了一种在E1互补产生细胞中生产腺相关病毒(AAV)的方法，其包括：(a)用以下物质转染E1互补产生：(i)包括E1A、E2A、E4和VA RNA的第一载体，所述E1A、E2A、E4和VARNA全部可操作地连接到第一启动子；以及(ii)包括Rep和Cap的第二载体，所述Rep和Cap可操作地连接到第二启动子，其中E1A与E2A、E4、VARNA、Rep和Cap中的每一个的拷贝数比为约1:1至约3:1；(b)在适于生产AAV的条件下培养经转染的E1互补产生细胞；和(c)从培养的E1互补产生细胞中纯化AAV，从而获得AAV。合适地，第一和第二载体中的一种或两种进一步包括选自E1B、NP1、NS2或其组合的辅助基因。合适地，E1B是E1B
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19k或E1B
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55k。合适地，辅助基因包括NP1和NS2的组合。在实施例中，该方法进一步包括用包括GOI的载体转染E1互补产生细胞。
附图说明
[0011]以下附图构成本说明书的一部分并且被包含以进一步阐述本专利技术的某些方面的示例性实施例。
[0012]图1显示了如本文实施例中所述的用于在E1互补产生细胞中生产AAV的标准三重转染质粒：含有E2A、E4和VARNA的pHelper质粒；含有Rep和Cap的pRep
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Cap质粒；和含有反向末端重复(ITR)序列和目标基因(GOI)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在E1互补产生细胞中生产腺相关病毒(AAV)的方法，其包括：a.用一种或多种载体转染所述E1互补产生细胞，所述载体包括：i.E1A腺病毒辅助基因；ii.选自E2A、E4或两者的腺病毒辅助基因；iii.病毒相关的非编码RNA(VA RNA)；以及iv.选自Rep、Cap或两者的AAV基因；b.在适于生产所述AAV的条件下培养经转染的E1互补产生细胞；以及c.从培养的E1互补产生细胞中纯化所述AAV，从而获得所述AAV。2.根据权利要求1所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)在单个载体上。3.根据权利要求1所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)在多于一个载体上。4.根据权利要求3所述的方法，其中(i)、(ii)和(iii)在第一载体上并且(iv)是第二载体。5.根据权利要求3所述的方法，其中(i)在第一载体上，(ii)和(iii)在第二载体上，并且(iv)在第三载体上。6.根据权利要求3所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的每一个在单独的载体上。7.根据权利要求5或6所述的方法，其中包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一种以约1:1至约5:1的比率转染到所述E1互补产生细胞中。8.根据权利要求7所述的方法，其中转染到所述E1互补产生细胞中的包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一个的比率是1:1。9.根据权利要求7所述的方法，其中转染到所述E1互补产生细胞中的包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一个的比率是2:1。10.根据权利要求7所述的方法，其中转染到所述E1互补产生细胞中的包括(i)的载体与包括(ii)、(iii)和(iv)的载体中的每一个的比率是3:1。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)可操作地连接到一个或多个启动子。12.根据权利要求11所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的每一个可操作地连接到单独的启动子。13.根据权利要求12所述的方法，其中与可操作地连接到(ii)、(iii)和(iv)的启动子相比，可操作地连接到(i)的启动子提供基本上相同的表达水平。14.根据权利要求12所述的方法，其中与可操作地连接到(ii)、(iii)和(iv)的启动子相比，可操作地连接到(i)的启动子提供至少2倍的表达。15.根据权利要求12所述的方法，其中与所述可操作地连接到(ii)、(iii)和(iv)的启动子相比，所述可操作地连接到(i)的启动子提供至少3倍的表达。16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其中(i)可操作地连接到启动子，并进一步可操作地连接到增强子，并且其中(ii)、(iii)和(iv)未可操作地连接到增强子。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中在所述一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的拷贝数比为约1:1至约5:1。18.根据权利要求17所述的方法，其中在所述一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和
(iv)中的每一个的拷贝数比是1:1。19.根据权利要求17所述的方法，其中在所述一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的拷贝数比是2:1。20.根据权利要求17所述的方法，其中在所述一个或多个载体上(i)与(ii)、(iii)和(iv)中的每一个的拷贝数比是3:1。21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中(ii)包括E2A和E4。22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中(iv)包括Rep和Cap。23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述培养包括以与(ii)、(iii)和(iv)中的每一种的约1:1至约5:1的比率表达E1A。24.根据权利要求23所述的方法，其中E1A的表达与(ii)、(iii)和(iv)中的每一种的表达的比率是1:1、2:1或3:1。25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述一个或多个载体进一步包括(v)选自E1B、NP1、NS2或其组合的辅助基因。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述E1B是E1B
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19k或E1B
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55k。27.根据权利要求25所述的方法，其中(v)包括NP1和NS2。28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中(i)和(v)在单个载体上。29.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中(v)位于与(i)、(ii)、(iii)和(iv)分开的载体上。30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾炳南，J，
申请(专利权)人：隆萨休斯敦股份有限公司，
类型：发明
国别省市：