一种抗人Claudin18.2的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗人Claudin18.2的单克隆抗体及其应用。该抗体具有如SEQ ID NO:2~4所示的轻链互补决定区，以及如SEQ ID NO:5~7所示的重链互补决定区。本发明专利技术提供的单克隆抗体能与人Claudin18.2蛋白特异结合，且与人Claudin18.1蛋白无交叉反应，效价高，亲和力好，能够用于特异检测人Claudin18.2蛋白，通过免疫组化方法检测待检测标本组织中的Claudin18.2的表达情况，检测结果可以作为临床医生的诊断依据之一，为临床肿瘤的诊断起预后判断的作用，帮助临床肿瘤的诊断、分类、预后判断以及疗效评估。判断以及疗效评估。判断以及疗效评估。

【技术实现步骤摘要】
一种抗人Claudin18.2的单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种分泌抗人Claudin18.2单克隆抗体的杂交瘤细胞及应用。

技术介绍

[0002]Claudin蛋白是在鸡的肝脏中发现的一类存在于细胞上的4次跨膜蛋白，是构成紧密连接的重要组成部分，其具有黏附细胞、维持细胞极性、调节细胞通透性以及参与细胞增殖和分化的调节等功能。Claudin18是目前Claudin 蛋白家族中研究最为深入的一种，包括Claudin18.1和 Claudin18.2两种亚型。正常情况下Claudin18.2蛋白主要表达在胃黏膜上皮细胞，而不表达于人体其他健康组织中。但其在胃癌、食管癌、胰腺癌等癌变组织中表达明显上调，并能够参与肿瘤细胞的增殖、分化及转移。目前，利用免疫组织化学方法对关键肿瘤相关蛋白进行组织学检测是关系到肿瘤精准诊疗的重要节。如何准确、快速的检测出各肿瘤组织Claudin18.2的表达情况是靶向免疫治疗的关键。
[0003]由于Claudin18.1和Claudin18.2氨基酸序列仅有极小的差异，目前市面上大多数claudin18.2抗体并不能特异性识别Claudin18.2而不识别Claudin18.1，因此，一种抗人Claudin18.2的单克隆抗体及其应用亟待提出。

技术实现思路

[0004]为解决现有技术存在的缺陷，本专利技术提供一种分泌抗Claudin18.2单克隆抗体的杂交瘤细胞及应用，该单克隆抗体不与任何其他Claudin家族成员结合，其中包括Claudin18.1蛋白亚型，并且目前尚没有任何其它Claudin18.2抗体经过大量组织标本的免疫组化验证并显示出可以通过对Claudin18.2的组织细胞表达水平进行检测来达到对胃癌恶性度及患者生存情况进行预后预判的目的。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：本专利技术的第一目的提供一种抗人Claudin18.2的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够特异性识别人Claudin18.2蛋白，所述识别位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述单克隆抗体具有如SEQ ID NO:2所示的轻链互补决定区CDR1、如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区CDR2和如SEQ ID NO:4所示的轻链互补决定区CDR3、以及如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区CDR1、如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区CDR2和如SEQ ID NO:7所示的重链互补决定区CDR3。
[0006]优选的，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
[0007]本专利技术的第二目的提供一种核酸组合物，包括编码抗人Claudin18.2的单克隆抗体的核酸分子。
[0008]本专利技术的第三目的提供一种检测试剂盒，所述试剂盒中还含有柠檬酸盐缓冲液、内源性过氧化酶阻断剂、酶标羊抗鼠IgG聚合物、DAB缓冲液、DAB底物、DAB显色剂、PBS磷酸
盐缓冲液、抗人Claudin18.2的单克隆抗体。
[0009]本专利技术的第四目的提供一种抗人Claudin18.2的单克隆抗体在制备用于免疫组化检测的试剂中的应用。
[0010]本专利技术相较于现有技术，具有以下有益效果：本专利技术提供的单克隆抗体能与Claudin18.2蛋白特异结合，不与Claudin18.1产生交叉反应，效价高，亲和力好，能够用于特异检测人Claudin18.2蛋白，并用于胃癌的免疫组化检测。本专利技术提供抗体为核心的免疫组化检测方法，能很好地检测胃癌组织细胞中Claudin18.2的表达量和表达位置，便于从免疫组化图中直接判读Claudin18.2在癌组织细胞中的定位和表达情况，并以此为依据判别胃癌的个体化异质性及其生存预后。
附图说明
[0011]图1是本专利技术实施例1中SDS
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PAGE结果示意图；图2是本专利技术实施例1中蛋白质印迹分析结果示意图；图3是本专利技术实施例2中SDS
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PAGE结果示意图；图4是本专利技术实施例2中蛋白质印迹分析结果示意图；图5是本专利技术实施例5中Claudin18.2在浆中呈弱阳性着色的示意图；图6是本专利技术实施例5中Claudin18.2在浆中呈强阳性着色的示意图；图7 是本实施例7中免疫印迹法确认抗体特异性的结果示意图。
具体实施方式
[0012]以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0013]本专利技术中基因Claudin18.2的GeneBank国际通用序列编号为：NC_000003.12，基因Claudin18.2编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为：NP_001002026.1。
[0014]实施例1：Claudin18.2的重组蛋白表达、纯化及鉴定从胃癌组织中利用RT
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PCR的方法，利用Claudin18.2
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F、Claudin18.2
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R为引物克隆Claudin18.2基因（其中，Claudin18.2
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F的基因序列如SEQ ID NO：10所示，Claudin18.2
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R的基因序列如SEQ ID NO：11所示，Claudin18.2基因的基因序列如SEQ ID NO：12所示），然后将克隆的Claudin18.2基因插入含有His标签的改造过pc
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DNA3.1载体上，得Claudin18.2
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pc DNA3.1。然后将Claudin18.2
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pc DNA3.1转化DH5α，挑取阳性克隆，将挑取的阳性克隆扩大培养后，提取重组质粒Claudin18.2
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pc DNA3.1，然后以HindⅢ、BamHI进行酶切分析，结果显示得到了与预期大小相符的酶切片段。将酶切正确的重组Claudin18.2
‑
pc DNA3.1经测序确认基因正确后利用Lipofectamine2000转染入292T细胞中，经过G418筛选阳性克隆，以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养（37℃，5%CO2），收集培养上清并纯化，细胞表达产物经SDS
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PAGE分析，结果如图1所示。结果显示，发现在26KD左右有特异表达带。用anti
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6x
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His 抗体进行蛋白质印迹分析，结果如图2所示，仅有一条特异性条带，表明蛋白为目的蛋白。
[0015]利用镍柱纯化细胞培养上清，具体方法为收集细胞培养液，1200 rpm离心分离细胞，收集上清，并利用0.45μm 滤器过滤上清液。将滤液上样到5ml Ni
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NTA 柱上，经5倍柱体
积10mM咪唑溶液清洗，然后用300mM咪唑洗脱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗人Claudin18.2的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体能够特异性识别人Claudin 18.2蛋白，识别位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述单克隆抗体具有如SEQ ID NO:2所示的轻链互补决定区CDR1、如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区CDR2和如SEQ ID NO:4所示的轻链互补决定区CDR3、以及如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区CDR1、如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区CDR2和如SEQ ID NO:7所示的重链互补决定区CDR3。2.根据权利要求1所述的抗人Claudin18.2的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷霞，庄光磊，狄文，龙潇冉，周小进，
申请(专利权)人：苏州仁端生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：