一种提高水稻tms5两系不育系不育起点温度的方法技术

本发明专利技术提供一种提高水稻tms5两系不育系不育起点温度的方法，包含以下步骤：在水稻TMS5基因翻译起始位点ATG下游22bp及57bp处分别设计CRISPR/Cas9基因编辑靶点T501与T502，构建基因编辑载体TMS501与TMS502，转化水稻品种，实现对TMS5基因的定点突变，获得不同复等位基因型的tms5基因移码突变体材料。实验证明，在同一遗传背景下，通过T501靶点编辑产生的tms5

【技术实现步骤摘要】
一种提高水稻tms5两系不育系不育起点温度的方法


[0001]本专利技术属于植物转基因技术及作物遗传育种领域，具体涉及一种提高水稻tms5两系不育系不育起点温度的方法，利用CRISPR
‑
Cas9技术，通过定点编辑水稻TMS5基因的翻译起始位点ATG下游22bp处，实现移码突变，从而获得不育起点温度显著提高的水稻tms5两系不育系。

技术介绍

[0002]两系杂交稻育种过程中，选育出低不育起点温度的两系不育系对于生产合格的杂交稻种子至关重要，而当前生产上应用的tms5不育系表现出并不完全相同的不育起点温度，其遗传调控机制较为复杂。前人研究认为，多个微效基因间的互作决定了光温敏核不育水稻的不育起点温度，而遗传基础不纯可能是不育起点温度“遗传漂变”的内在原因。近年来，多个研究团队利用CRISPR/Cas9技术对多个籼稻与粳稻品种进行TMS5位点编辑，获得的大多数籼型不育系起点温度低于24℃，符合两系不育系育种的实际需求，但所有粳型不育系起点温度高于26℃，有些材料甚至要在32℃条件下才能完全不育，这种育性特征不能适应两系稻育种的实际生产需求。以上结果说明不同的tms5不育系材料因遗传背景的差异可表现出显著不同的温敏不育起点温度，粳稻材料不育起点温度过高，不能适应生产需求。周海、陈日荣、黄忠明等认为，不同tms5不育系的雄性不育起点温度由不同水稻品种的遗传背景决定，与tms5突变基因本身无关。
[0003]前期研究中，我们通过对一系列tms5突变体不育起点温度的分析发现，相同靶位点的tms5突变体，粳稻背景下的tms5突变体不育起点温度较籼稻的高，这与前人报道的一致。但我们同时发现，在同一遗传背景下，不同靶位点突变体的不育起点温度也有所不同。无论在粳稻日本晴，还是在籼稻明恢86背景下，T501靶位点突变体(tms5
‑
1)的不育起点温度显著高于T502等其他靶位点上产生的突变体的不育起点温度，这一新现象目前尚未见报道。进一步表达分析发现，在明恢86及日本晴背景下，3种Ub
L40
的mRNA都是在较低不育起点温度的tm5
‑
2突变体中表达量较高，在较高不育起点温度的tms5
‑
1突变体的表达量较低，这一结果与目前对不育起点温度差异的解释相符。
[0004]从目前已有的有关水稻tms5突变体的研究看，不同的研究者均观察到tms5突变体不育起点温度受不同遗传背景的影响，但对其具体的作用机制尚缺少深入了解。这可能是相关研究涉及的遗传背景太复杂，直接分析较为困难，需要新的发现和新的材料产生。本研究在分析基因编辑创制的tms5突变体不育起点温度过程中，发现tms5不育起点温度不仅受遗传背景的影响，也受某些不同靶位突变体的影响，对这些tms5突变体的系统分析和深入研究可为揭示水稻tms5突变体不育起点温度的分子机理提供新思路。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种利用CRISPR
‑
Cas9技术，通过定点编辑水稻TMS5基因的翻译起始位点ATG下游22bp位置，实现移码突变，从而培育不育起点温度显著提高的水稻
tms5两系不育系的方法。
[0006]本专利技术的另一目的在于利用同一遗传背景但表现不同不育起点温度的tms5突变体进行两系水稻不育起点温度遗传调控机制的研究应用。
[0007]本专利技术是通过以下技术方案实现的：所述一种利用CRISPR
‑
Cas9技术编辑水稻TMS5基因的翻译起始位点ATG下游22bp位置，培育不育起点温度显著提高的水稻tms5两系不育系的方法，特别适合于在同一遗传背景进行tms5两系水稻不育起点温度遗传调控机制的研究应用；包含如下步骤：1)优选的TMS5基因第一外显子中的23bp序列5'
‑
GAACAGCGGCAAGTCATCGCCGG
‑
3'作为sgRNA靶序列。所述sgRNA特异性靶向TMS5基因翻译起始位点ATG下游22bp位置。sgRNA的序列如下：5'
‑
GAACAGCGGCAAGTCATCGC
‑
3'。
[0008]2)参照CRISPR/Cas9编辑技术，构建CRISPR
‑
TMS501基因编辑载体。
[0009]3)采用农杆菌介导的遗传转化方法，将CRISPR
‑
TMS501基因编辑载体转入水稻，获得再生植株。
[0010]4)参照所述sgRNA靶向的TMS5基因序列，依据PCR引物设计原理，在所述sgRNA靶位点处上下游100
‑
500bp处设计TMS5基因特异性引物，引物碱基序列如下:TMS5F：5'
‑
CCATCGTGCTTCGTGCCA
‑
3'如SEQ ID NO.1所示TMS5R:5'
‑
GAGTTCTTGGTACATGAGTGC
‑
3'如SEQ ID NO.2所示5)利用所述引物PCR扩增TMS5基因的基因组片段并进行测序鉴定，筛选TMS5基因靶位点发生碱基插入或缺失的移码tms5突变株。
[0011]6)在田间及人工气候箱条件下对各突变株进行花粉育性调查鉴定，获得温敏雄性不育系，繁殖突变株系。
[0012]一种利用同一遗传背景但表现不同不育起点温度的tms5突变体进行两系水稻不育起点温度遗传调控机制的研究应用，应用具体是，可在同一遗传背景下，利用所述较高不育起点温度的tms5突变体与较低不育起点温度突变体进行幼穗发育期差异表达基因的筛选与分析，挖掘与不育起点温度有关的基因，为研究水稻tms5两系不育起点温度的分子机理及遗传调控网络提供新策略。
[0013]本专利技术具有如下的有益效果：1、本专利技术利用TMS5基因及其蛋白参与水稻花粉育性发育调控的特点及CRISPR/Cas9系统的基因组靶向修饰，通过定点突变该基因，可创制温敏核不育水稻，在杂交水稻生产上具有十分重要的应用。
[0014]2、本专利技术利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点突变水稻TM5基因翻译起始位点ATG下游22bp处，获得了不育起点温度显著提高的水稻tms5突变体，是一种全新的遗传研究材料，具有重要的研究利用价值。
[0015]3、本专利技术为研究水稻tms5两系不育起点温度的分子机理及遗传调控网络提供了新思路与新策略。
附图说明
[0016]图1：明恢86中两个突变株系的序列测序结果，左图序列为T501靶点处插入1个碱
基A的移码突变，右图的序列为T502靶点处插入1个碱基A的移码突变。
[0017]图2：明恢86和日本晴两种遗传背景的野生型、tms5
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1突变体及tms5
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2突变体穗部开花特征。两种背景的tms5突变体育性敏感期处于福州8月初的自然长日高温条件，MH86为明恢86，NIP为日本晴，M
‑
#和N
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高水稻tms5两系不育系不育起点温度的方法，其特征在于：利用CRISPR/Cas9基因编辑系统在水稻TMS5基因翻译起始位点ATG下游22bp处实现移码编辑，产生新型tms5复等位基因型，从而获得不育起点温度显著提高的tms5突变体；所述CRISPR/Cas9基因编辑系统由CRISPR
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TMS501质粒载体组成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述CRISPR
‑
TMS501基因编辑载体特异性针对水稻TMS5基因翻译起始位点ATG下游22bp处进行定点突变，其sgRNA的序列如下：5'
‑
GAACAGCGGCAAGTCATCGC
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3'。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述sgRNA所靶标的水稻基因序列如下：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴明基，刘华清，陈建民，王锋，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：