引物组和探针、试剂盒、检测猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种引物组和探针，包含核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1

【技术实现步骤摘要】
引物组和探针、试剂盒、检测猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种引物组和探针、试剂盒、检测猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的方法。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）是一种猪肠道病毒，可引起猪的腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。目前PED的防控主要是依靠疫苗免疫，而PEDV CV777弱毒疫苗的使用对临床检测结果造成干扰，因此需要依靠精确的诊断技术对疫苗株和野毒株进行鉴别检测和诊断。
[0003]目前，针对PEDV野毒株和疫苗株的区分主要使用RT
‑
PCR、qRT
‑
PCR等扩增技术，但是RT
‑
PCR等技术在实际操作中存在所需时间长、工作量大、易污染等缺点。因此，专利技术一种快速、特异性强、敏感性高的PEDV野毒株和疫苗株的鉴别诊断和检测方法具有重要的应用前景。
[0004]环介导等温扩增法（loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP），是一种等温的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的多个区域设计多条特异引物，在链置换DNA聚合酶（Bst2.0 WarmStart
®ꢀ
DNA聚合酶）的作用下，60~65℃恒温扩增，15
‑
60分钟左右即可实现109～10
10
倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。LAMP引物组一般由内引物FIP（F1c+F2）和BIP（B1c+B2），外引物F3和B3以及环引物LoopF/LoopB组成。环引物是设计在F1c和F2之间或者B1c和B2之间的引物，其主要是在LAMP正常延伸反应启动的前提下，起到大大提高等温扩增效率的作用。LAMP具有操作简便、反应时间快和检测灵敏的特点，不需要贵重的荧光定量仪器，只需简易的加热装置即可反应，有较好的临床应用前景。
[0005]针对环介导等温扩增法，现有技术如下：现有技术1：CN112553377A公开了二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒（Marek
’
s disease virus，MDV）疫苗株和强毒株检测引物组，包括引物1至引物8，其中引物7和引物8为2条Taqman探针，它们使扩增反应具有很高的特异性，能分别与MDV meq基因区分疫苗株和强毒株的差异位点结合，反应后在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光，从而实现快速敏感特异的鉴别MDV疫苗株和强毒株。
[0006]该方法主要通过引物7来检测强毒株，通过引物8来检测疫苗株。
[0007]现有技术2：CN107034314A公开了一种鉴别MEV野毒株与MEVB毒株的LAMP引物组、试剂盒及方法。所述LAMP引物组包括F3和B3组成外引物对和FIP和BIP组成的内引物对。所述试剂盒包括所述LAMP引物组、反应混合液以及DNA聚合酶。
[0008]该方法主要通过特异性的扩增野毒株来进行荧光识别。
[0009]现有技术1开发难度大，需要增加针对基因的特异性荧光引物的条数；现有技术2局限性大，不能区分是否具有仅含有疫苗株不含有野毒株的情况，实际上在生产过程中，不仅仅需要识别野毒株，还应该识别鉴别对象是否进行免疫过或是感染过野毒株。
[0010]所以，本案解决的技术问题是：如何用1条针对基因特异性的荧光探针和一条非特异性的淬灭探针识别猪流行性腹泻病毒的野毒株和疫苗株。

技术实现思路

[0011]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种引物组和探针；该引物组能够对野毒株、疫苗株均进行扩增，对于野毒株与疫苗株存在差异的ORF3基因区域开发出荧光探针，用于进行荧光的特征性反应，实现了对猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的高特异性、敏感性的快速定量检测。
[0012]同时，本专利技术还提供了一种试剂盒、检测猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的方法。
[0013]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种引物组和探针，包含核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1
‑
6所示的FIP、BIP、F3、B3、LoopF和LoopB组成的引物组以及如SEQ ID NO：7
‑
8所示的荧光探针probe和淬灭探针Quencher。
[0014]在上述的引物组和探针中，所述荧光探针probe的5
’
端携带荧光基团FAM，3
’
端不携带荧光基团；淬灭探针Quencher的5
’
端携带淬灭基团BHQ1，3
’
端不携带荧光基团。
[0015]相较于CN112553377A，本案采用的是2条探针（荧光探针和淬灭探针），而CN112553377A的每条探针都需要5
’
和3
’
端都修饰，所以CN112553377A整个试剂盒的试剂复杂性、开发难度都显著增加。本案通过目标基因和淬灭探针争夺荧光探针实现发光，其实现难度更低。
[0016]同时，本专利技术还提供了一种试剂盒，包括如上所述的引物组和探针、在酸性状态下显色的指示剂。
[0017]在上述的试剂盒中，应用试剂盒构成的检测体系包括：Isothermal Amplification Buffer（10
×
）2.5μL、Bst DNA polymerase 1μL、WarmStarRTx 0.5μL、dNTPs 4μL、MgSO
4 1.5μL、FIP引物和BIP引物4μL、F3引物和B3引物0.5μL、LoopF引物 2μL、LoopB引物 2μL、荧光探针probe 0.35μL、淬灭探针Quencher 1μL、RNA模板 1μL、含所述指示剂的ddH2O 4.65μL。
[0018]在上述的试剂盒中，所述指示剂为甲酚红。
[0019]同时，本专利技术还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒野毒株和疫苗株的方法，采用如上所述的试剂盒进行检测。
[0020]在上述的检测猪流行性腹泻病毒的野毒株和疫苗株的方法中，采用如上所述的试剂盒进行检测；如果所述检测体系中甲酚红显色，说明检测体系中含有猪流行性腹泻病毒的野毒株和/或疫苗株；如果所述检测体系在荧光下显色，说明检测体系中含有野毒株；如果所述检测体系中甲酚红显色且在荧光下不显色，说明检测体系中不含有野毒株、仅含有疫苗株。
[0021]相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术设计的荧光基团修饰的环引物探针和与之互补的淬灭探针，特异互补结合时，产生荧光信号；可通过荧光定量扩增仪器和便携式一体化反应装置实现对PEDV野毒株
和疫苗株的区分检测和实时观察。
[0022]随着反应的进行核酸随之扩增，在此过程中会产生氢离子，使反应体系pH值降低，通过溶液的颜色变化来判定PEDV野毒株和疫苗株的反应结果。
[0023]当样本中有PEDV野毒株的核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物组和探针，其特征在于，包含核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1
‑
6所示的FIP、BIP、F3、B3、LoopF和LoopB组成的引物组以及如SEQ ID NO：7
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8所示的荧光探针probe和淬灭探针Quencher。2.根据权利要求1所述的引物组和探针，其特征在于，所述荧光探针probe的5
’
端携带荧光基团FAM，淬灭探针Quencher的5
’
端携带淬灭基团BHQ1。3.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物组和探针、在酸性状态下显色的指示剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，应用试剂盒构成的检测体系包括：Isothermal Amplification Buffer（10
×
）2.5μL、Bst DNA polymerase 1μL、WarmStarR...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志成，勾红潮，沈海燕，张春红，乌日尼乐，聂晶晶，瞿云芝，张建峰，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：