一种检测布鲁氏菌抗原的免疫试纸卡及其制备方法和应用技术

技术编号:39141950 阅读:17 留言:0更新日期:2023-10-23 14:55
本发明专利技术涉及生物检测技术领域,尤其涉及一种检测布鲁氏菌抗原量子点微球免疫试纸卡及制备方法和应用。免疫试纸卡,包括PVC底板,在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、量子点结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;量子点结合垫内包被有量子点标记抗布鲁氏菌单克隆抗体;硝酸纤维素膜表面上设置有检测线和质控线,检测线内包被有抗布鲁氏菌单克隆抗体,质控线内包被有羊抗鼠IgG抗体。本发明专利技术的免疫试纸卡适用于带有牛和羊阴道分泌物和流产胎儿羊水的拭子内布鲁氏菌的检测,可在短时间内诊断出布鲁氏菌感染,特别适合现场布鲁氏菌感染诊断、流行病学调查和活牛/羊国际贸易检疫检验,具有使用方便、操作迅速简单、准确率高的技术优势。准确率高的技术优势。准确率高的技术优势。

【技术实现步骤摘要】
一种检测布鲁氏菌抗原的免疫试纸卡及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
,尤其涉及一种检测布鲁氏菌抗原量子点微球免疫试纸卡及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]布鲁氏菌病(brucellosis),又称布氏杆菌病、布病、波状热,是由布鲁氏菌(Brucella)所引起的动物源性传染病,人类常通过接触感染动物的排泄物,或者摄入由感染或患病动物制成的食品而患病。
[0003]布鲁氏菌病的诊断是布鲁氏菌病研究的重点和难题,对病原的分离是确诊布鲁氏菌病的金标准,但鉴于病原的分离率较低,并且需要具备完善的生物安全防护设施,并且由非常有经验的专业人员操作才能完成,此技术不能普遍应用,因而布鲁氏菌病的诊断方法的探索及研究,对布鲁氏菌病的筛检和确诊至关重要。我国现有的布鲁氏菌病实验室诊断技术标准(GB/T 18646

2018)包括细菌培养,血清学检测方法和病原学检测方法,其中血清学检测方法又包括虎红平板试验(RBT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)等。虎红平板凝集试验因其敏感性较低、特异性不高而容易漏检或误检,不能区分免疫抗体和感染抗体,仅适用于布鲁氏菌病的初筛。试管凝集试验有较高的特异性,但其敏感性依然低,且操作复杂、耗时长,不适合大批量检测,在实际操作中应用不方便,使用RBT、SAT进行检测方法存在人为判定因素影响,存在一定的局限性,因而国际贸易中不主张使用SAT试验。补体结合试验尽管特异性强,但操作较其他方法复杂,且阳性出现时间较晚,在人医上仅用于诊断比较困难的人群。由于条件要求较苛刻,试剂昂贵,基层兽医难以开展,其应用受到极大限制。酶联免疫吸附试验(ELISA)和多聚酶链式反应(PCR)检测方法,需要具备相对独立的实验室条件,操作人员的技术水平要求较高,并且实验时间过长,无法满足临床快速检测的要求。故开发特异、灵敏能解决临床快速检测的方法仍是目前亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题,本专利技术提供了一种检测布鲁氏菌抗原量子点微球免疫试纸卡及制备方法和应用。
[0005]本专利技术提出一种检测布鲁氏菌抗原的免疫试纸卡,包括PVC底板,在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、量子点结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;量子点结合垫内包被有量子点标记的抗布鲁氏菌单克隆抗体;硝酸纤维素膜表面上设置有检测线和质控线,检测线内包被有抗布鲁氏菌单克隆抗体,质控线内包被有羊抗鼠IgG抗体。
[0006]可选的,抗布鲁氏菌单克隆抗体购自北京中科锐进科技有限责任公司。
[0007]可选的,量子点结合垫内量子点标记抗布鲁氏菌单克隆抗体包被的浓度为10~100μL/cm2,优选为50μL/cm2;检测线中抗布鲁氏菌单克隆抗体包被质量为每厘米检测线内包被0.5~3μg,优选为2μg;质控线中的羊抗鼠IgG抗体包被的包被质量为每厘米检测线内
包被0.5~3μg,优选为2μg;检测线与质控线之间距离为4~8mm,优选5mm。
[0008]可选的,量子点标记抗布鲁氏菌的单克隆抗体的制备方法包括以下步骤:
[0009]S1、活化量子点微球,加入MES缓冲液;
[0010]S2、于活化后的量子点微球溶液中,加入抗布鲁氏菌单克隆抗体,混合均匀后,35~38℃放置0.5~2小时;量子点微球与抗布鲁氏菌单克隆抗体的体积质量比为4:3~4,优选为4:3;量子点微球的单位为μL,抗体的单位为μg;量子点微球的直径为150~350nm,优选200nm;
[0011]S3、加入封闭剂后35~38℃放置一段时间,离心后加入MES缓冲液,35~38℃放置一段时间,制得含有量子点标记抗布鲁氏菌单克隆抗体的溶液;
[0012]MES缓冲液的配方为:0.01M~0.1M的MES,pH为6.5;
[0013]封闭剂为含1%BSA的甘氨酸缓冲液,甘氨酸的浓度为50mmol/L。
[0014]可选的,在S1中,活化采用EDC和NHS溶液进行活化,活化的条件为震荡反应3~10秒;优选的,量子点微球与EDC、NHS的质量比为1:20:20;每1mg量子点微球加入20~30mL、优选25mL的MES缓冲液。
[0015]本专利技术还提出上述免疫试纸卡的制备方法,包括以下步骤:
[0016]S1、将处理液体涂在结合垫上,干燥,制得预处理的结合垫;
[0017]S2、将含有量子点标记抗布鲁氏菌单克隆抗体的溶液涂在预处理的结合垫上,冷冻干燥,得到量子点结合垫;
[0018]S3、硝酸纤维素膜表面上喷涂检测线和质控线;检测线内包被抗布鲁氏菌单克隆抗体;质控线内包被羊抗鼠IgG抗体;
[0019]S4、将样品垫、量子点结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组装,得到检测布鲁氏菌抗原的免疫试纸卡。
[0020]可选的,处理液的组成为:
[0021]PEG20000:质量百分比浓度为0.2~1%;
[0022]BSA:质量百分比浓度为0.05~0.2%;
[0023]Tween

20:体积百分比浓度为0.01~0.1%;
[0024]优选为:
[0025]PEG20000:质量百分比浓度为0.5%;
[0026]BSA:质量百分比浓度为0.1%;
[0027]Tween

20:体积百分比浓度为0.05%;
[0028]在S2中,标记的量子点微球溶液1:100稀释后按50μL/cm2均匀涂在预处理的量子点结合垫上;
[0029]在S3中,布鲁氏菌单克隆抗体抗体的浓度为0.5~2mg/mL,优选为1mg/mL;羊抗鼠IgG抗体的浓度为0.5~2mg/mL,优选为1mg/mL。
[0030]本专利技术还提出一种检测布鲁氏菌抗原的试剂盒,包括上述免疫试纸卡,其特征在于,试剂盒中还含有样品稀释液,样品稀释液的组成为:
[0031]氯化钠:质量百分比浓度为0.3%~0.7%;
[0032]Na2HPO4:0.08mmol~0.12mmol;
[0033]酪蛋白:质量百分比浓度为0.3%~0.7%;
[0034]Tween

20:体积百分比浓度为0.5%~1.5%;
[0035]优选为:
[0036]氯化钠:质量百分比浓度为0.4%;
[0037]Na2HPO4:0.1mmol;
[0038]酪蛋白:质量百分比浓度为0.3%~0.7%;
[0039]Tween

20:体积百分比浓度为0.5%~1.5%。
[0040]本专利技术还提出一种布鲁氏菌抗原的检测方法,采用上述试剂盒,检测方法至少包括以下步骤:
[0041]将采样拭子浸泡至样品稀释液中,充分混匀后加入3~10滴,室温静置15~20分钟,插入便携免疫荧光分析仪,通过收集及分析免疫荧光分析仪检测到的荧光信号,转换成检测值;若本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测布鲁氏菌抗原的免疫试纸卡,其特征在于,包括PVC底板,在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、量子点结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;本发明还提出量子点结合垫内包被有量子点标记的抗布鲁氏菌单克隆抗体;所述硝酸纤维素膜表面上设置有检测线和质控线,所述检测线内包被有抗布鲁氏菌单克隆抗体,所述质控线内包被有羊抗鼠IgG抗体。2.根据权利要求1所述的免疫试纸卡,其特征在于,所述抗布鲁氏菌单克隆抗体购自北京中科锐进科技有限责任公司。3.根据权利要求1所述的免疫试纸卡,其特征在于:所述量子点结合垫内量子点标记抗布鲁氏菌单克隆抗体包被的浓度为10~100μL/cm2,优选为50μL/cm2;所述检测线中抗布鲁氏菌单克隆抗体包被质量为每厘米检测线内包被0.5~3μg,优选为2μg;所述质控线中的羊抗鼠IgG抗体包被的包被质量为每厘米检测线内包被0.5~3μg,优选为2μg;所述检测线与所述质控线之间距离为4~8mm,优选5mm。4.根据权利要求1所述的免疫试纸卡,其特征在于,所述量子点标记抗布鲁氏菌的单克隆抗体的制备方法包括以下步骤:S1、活化量子点微球,加入MES缓冲液;S2、于活化后的量子点微球溶液中,加入所述抗布鲁氏菌单克隆抗体,混合均匀后,35~38℃放置0.5~2小时;所述量子点微球与所述抗布鲁氏菌单克隆抗体的体积质量比为4:3~4,优选为4:3;量子点微球的单位为μL,抗体的单位为μg;所述量子点微球的直径为150~350nm,优选200nm;S3、加入封闭剂后35~38℃放置一段时间,离心后加入MES缓冲液,35~38℃放置一段时间,制得含有所述量子点标记抗布鲁氏菌单克隆抗体的溶液;所述MES缓冲液的配方为:0.01M~0.1M的MES,pH为6.5;所述封闭剂为含1%BSA的甘氨酸缓冲液,甘氨酸的浓度为50mmol/L。5.根据权利要求4所述的免疫试纸卡,其特征在于,在S1中,所述活化采用EDC和NHS溶液进行活化,活化的条件为震荡反应3~10秒;优选的,所述量子点微球与EDC、NHS的质量比为1:20:20;每1mg量子点微球加入20~30mL、优选25mL的MES缓冲液。6.如权利要求1~5任一项所述的免疫试纸卡的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:S1、将处理液体涂在结合垫上,干燥,制得预处理的结合垫;S2、将含有所述量子点标记抗布鲁氏菌单克隆抗体的溶液涂在所述预处理的结合垫上,冷冻干燥,得到所述量...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨若松华利忠许玉静马增彬李翀康福忠龚雅云梁春鸿丁炎炎杨立凤
申请(专利权)人:百沃特北京生物技术有限公司江苏农林职业技术学院
类型:发明
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