一种猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株的鉴别诊断方法及引物和探针组合技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株的鉴别诊断方法及引物和探针组合。所述引物和探针组合包括一种PNA探针，以及鉴别组合1、鉴别组合2或诊断组合，所述PNA探针的序列包括CAGTGATGATATATGCC。本发明专利技术针对不同谱系的猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株进行研究，得到高度保守的区域，基于这些区域设计了多个引物和探针组合，以及针对谱系5的PNA探针。采用本发明专利技术提供的引物和探针组合可以准确、有效地实现猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株的鉴别诊断，并且特异性强、敏感性高、检测限低。检测限低。检测限低。

【技术实现步骤摘要】
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株的鉴别诊断方法及引物和探针组合


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株的鉴别诊断方法及引物和探针组合。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproduction and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproduction and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以母猪流产、产木乃伊胎和弱仔等繁殖障碍以及各年龄猪呼吸系统疾病为特征的接触性传染病。PRRS流行范围较广，对养猪业生产造成了巨大威胁，其可经气溶胶传播，具有持续性感染、易变异和免疫抑制特性。同时该病疫苗对异源毒株交叉保护效果有限，存在毒力返强、毒株重组等风险，防控难度大。
[0003]PRRSV属于套式病毒目、动脉炎病毒科、猪动脉炎病毒属成员，具有囊膜，基因组为约15kb的单股正链RNA。PRRSV可分为PRRSV
‑
1型(又称欧洲型，代表株为Lelystad Virus，LV)和PRRSV
‑
2型(又称北美型，代表株为VR2332)，两种基因型序列同源性约为60％。目前流行的PRRSV毒株呈多样性，田间主要以PRRSV
‑
2型毒株为主。
[0004]猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株分为多个谱系，目前养殖业用于预防猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株的疫苗多是谱系5，由于猪繁殖与呼吸综合征病毒各谱系毒株基因组具有一定的相似性，谱系5对于猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株其他谱系的检测具有一定的干扰。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株的鉴别诊断方法及引物和探针组合。针对猪繁殖与呼吸综合征病毒2型谱系5毒株设计PNA探针对其进行遮蔽，有效提高猪繁殖与呼吸综合征病毒2型各谱系毒株的检测准确性。
[0006]本专利技术针对猪繁殖与呼吸综合征病毒基因2型各谱系毒株的基因序列进行研究分析，通过从GenBank中下载45条来源于不同国家不同年份的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因2型各谱系代表毒株基因序列，应用Geneious进行多序列比对分析，为将谱系5毒株与其他谱系毒株相区分，选择谱系5毒株相较其他谱系存在突变的区域进行引物设计，分别确定了谱系1高保守区段M蛋白编码区，谱系3与谱系8高保守区段Nsp4。同时，选取谱系5高保守区M蛋白区的特定区段，该区段序列异于谱系1、3、8高保守区序列设计谱系5扩增引物。
[0007]本专利技术进一步基于谱系5的高度保守区且为其他谱系的突变区设计相应的PNA探针。通过PNA探针设计原则：较短的高度保守片段、长度在12～18bp、嘌呤含量小于60％、避免6个以上连续嘌呤以及4个以上连续的G、避免自身互补等；基于谱系1、谱系3、谱系8高度保守区设计引物以及TaqMan
‑
MGB探针，TaqMan
‑
MGB探针设计原则：较短的高度保守片段、长度在13～25bp、Tm值在65～67℃、CG含量在30～80％、避免4个以上连续的G、5
’
端第一二个
碱基均不能为G等。引物设计原则：碱基随机分布的保守区域、长度在18～25bp、Tm值在55～62℃、CG含量在40～60％、避免引物二聚体及发卡结构。
[0008]本专利技术进一步应用Primer Premier 5.0、Oligo 7.0以及Primer
‑
BLAST等多种方式优化探针引物序列。通过上述设计得到一种具备较高特异性和敏感性的引物和探针组合，其可以有效抑制谱系5的扩增，在检测时用于谱系5猪繁殖与呼吸综合征疫苗株的排除。
[0009]本专利技术针对猪繁殖与呼吸综合征病毒基因2型各谱系基因序列进行研究分析，从GenBank中下载45条来源于不同国家不同年份的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因2型各谱系代表毒株基因序列，应用Geneious进行多序列比对分析，于猪繁殖与呼吸综合征病毒保守区M蛋白序列内得到了其高度保守的区域。通过TaqMan探针设计原则：(1)富含CG的高度保守片段，(2)长度在25～32bp，(3)Tm值在65～70℃，(4)CG含量在30～80％，(4)避免4个以上连续的G、5
’
端第一个碱基不能为G等；以及引物设计原则：(1)碱基随机分布的保守区域，(2)长度在18～25bp，(3)Tm值在55～62℃，(4)CG含量在40～60％，(4)避免引物二聚体及发卡结构等要求筛选到满足上述条件的高度保守序列。本专利技术进一步应用Primer Premier 5.0、Oligo 7.0以及Primer
‑
BLAST等多种方式优化探针引物序列。将优化的探针及引物序列于NCBI进行Nucleotide BLAST验证，该探针及引物序列在100条(BLAST极限数目为100条)猪繁殖与呼吸综合征病毒基因2型毒株基因序列中均为100％保守。
[0010]通过上述设计方法，本专利技术得到多个特定的靶点区域和针对这些区域的具备较高特异性和敏感性的引物和探针组合。针对这些特定区域设计得到的引物和探针组合相对于其他已公开的保守区域，具备更低的检测限。
[0011]第一方面，本专利技术提供一种PNA探针，包括：
[0012]CAGTGATGATATATGCC。
[0013]第二方面，本专利技术提供一种引物和探针组合，包括所述PNA探针，以及鉴别组合1、鉴别组合2或诊断组合中的一种或多种，所述鉴别组合1包括：
[0014]上游引物Nsp4
‑
F：5
’‑
CTTGTCGGCGTTCACAC
‑3’
，
[0015]下游引物Nsp4
‑
R：5
’‑
CACATTACAAAACTGGCCTGA
‑3’
，
[0016]荧光探针Nsp4
‑
MGB：5
’‑
FAM
‑
TCAAACAAACAAGGAGGAGG CA
‑
MGB
‑3’
；
[0017]所述鉴别组合2包括：
[0018]上游引物M2
‑
F：5
’‑
TTGGCGTTTTCTATCACCTAC
‑3’
，
[0019]下游引物M2
‑
R：5
’‑
TACCCAAAAGTGAAAGCACA
‑3’
，
[0020]荧光探针M2
‑
MGB：5
’‑
FAM
‑
ACGCCAATAATGATATATGCC
‑
MGB
‑3’
；
[0021]所述诊断组合包括：
[0022]上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PNA探针，其特征在于，包括：CAGTGATGATATATGCC。2.一种引物和探针组合，其特征在于，包括权利要求1所述的PNA探针，以及鉴别组合1、鉴别组合2或诊断组合中的一种或多种，所述鉴别组合1包括：上游引物Nsp4
‑
F：5
’‑
CTTGTCGGCGTTCACAC
‑3’
，下游引物Nsp4
‑
R：5
’‑
CACATTACAAAACTGGCCTGA
‑3’
，荧光探针Nsp4
‑
MGB：5
’‑
FAM
‑
TCAAACAAACAAGGAGGAGG CA
‑
MGB
‑3’
；所述鉴别组合2包括：上游引物M2
‑
F：5
’‑
TTGGCGTTTTCTATCACCTAC
‑3’
，下游引物M2
‑
R：5
’‑
TACCCAAAAGTGAAAGCACA
‑3’
，荧光探针M2
‑
MGB：5
’‑
FAM
‑
ACGCCAATAATGATATATGCC
‑
MGB
‑3’
；所述诊断组合包括：上游引物PRRSV
‑
M
‑
F：5
’‑
GTACATTCTGGCCCCTGCC
‑3’
，下游引物PRRSV
‑
M
‑
R：5
’‑
TTCTGCCACCCAACACGAG
‑3’
，荧光探针PRRSV
‑
M：5
’‑
FAM
‑
ATAACCACGCATTTGTCGTCCG GCGT
‑
BHQ1
‑3’
。3.根据权利要求2所述的引物和探针组合，其特征在于，由所述的PNA探针，所述的鉴别组合1，所述的鉴别组合2和所述诊断组合组成。4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的PNA探针，或权利要求2或3所述的引物和探针组合。5.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒2型毒株的鉴别诊断方法，其特征在于，包括：获得待测样品的cDNA；采用权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：周磊，姚力文，吴伟鑫，盖新娜，张永宁，韩军，郭鑫，杨汉春，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：