一种在RNA-seq中去除核糖体RNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种在RNA

【技术实现步骤摘要】
一种在RNA
‑
seq中去除核糖体RNA的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种在RNA
‑
seq中去除核糖体RNA的方法。

技术介绍

[0002]RNA高通量测序(RNA
‑
sequencing,缩写为RNA
‑
seq)是目前高通量测序技术中被用得最广的一种技术，RNA
‑
seq可以帮助我们了解：各种比较条件下，所有基因的表达情况的差异。
[0003]转录组(transcriptome)是指在某一特定的生理条件下，细胞、组织或者生物体内所有的转录产物的集合，即转录出来的所有RNA总和，包括编码RNA(即mRNA)和非编码RNA(ncRNA)。在这之中核糖体RNA(rRNA)约占RNA总量的80％，是最多的一类RNA，通常这类RNA分子量比较大且代谢不活跃，种类包括：原核生物中5SrRNAs、16S rRNAs和23S rRNAs三种，真核生物中5S rRNAs、5.8S rRNAs、18S rRNAs和28S rRNAs四种。
[0004]随着人类基因组计划(HGP)和DNA元件百科全书计划(ENCODE)的完成，人们发现在人类基因组中大部分DNA都可以转录成RNA，但是仅有1.5％的核苷酸序列用于蛋白质的编码，剩余不编码蛋白质的的非编码RNA(ncRNA)，被认为是基因组转录噪音。这种转录组噪音(无效信息)基本全部来源于丰度最高的成员——rRNA。
[0005]测序的目的就是为了更多的获得生物信息，但是rRNA这个在RNA中最丰富的成员却只能提供非常少的转录本的信息，且检测到过多的rRNA会掩盖其它基因的表达丰富度；因此，通常在测序之前从RNA样品中除去rRNA，rRNA去除的效率也被视为最大化读取到转录物的关键因素。
[0006]目前已经报道的rRNA去除方法主要有：第一种，RNA酶消化法。去除流程：针对不同物种设计不同的DNA探针与rRNAs杂交，然后利用RNA酶H的专一消化DNA和RNA的杂交链的RNA的特异性，消化rRNAs；然后利用DNA酶I来消化DNA探针，未被消化的其他RNA经过富集、纯化。第二种，通过DNA探针或者RNA探针杂交捕获rRNA再用磁珠吸附去除的方法。利用有生物素标记的探针与rRNAs进行杂交，杂交之后使用带有链霉亲和素的磁珠来去除探针与rRNAs的杂交产物，其他的进行RNA富集纯化。
[0007]现有方法存在试剂价格高昂、实验步骤长、耗时长、对样本来源和RNA丰度要求高、试剂难以储存等缺陷，严重阻碍了RNA二代测序建库技术的工业自动化发展和其在疾病快速诊断领域的应用。在传统rRNAs的去除方案中，都要经过多步骤、长时间的RNA操作，然而RNA极不稳定，容易被RNA酶所降解，这会导致低丰度的靶RNA极难检测出，特别对于样本量少的情况更是如此；并且富集完mRNA后，需要进行对靶RNA进行打断，在片段化的RNA上进行建库，此过程需要非传统的DNA建库试剂，导致成本增加，并且不能用于全长测序。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种在RNA
‑
seq中去除核糖体RNA的方法。
[0009]第一方面，本专利技术要求保护一种在RNA
‑
seq中去除核糖体RNA的方法。
[0010]本专利技术要求保护的在RNA
‑
seq中去除核糖体RNA的方法，可包括如下步骤：利用特异性探针(命名为聚合酶扩增阻碍探针)阻断靶核糖体RNA的cDNA扩增，实现去除所述靶核糖体RNA的污染。所述靶核糖体RNA即为待去除的核糖体RNA。
[0011]其中，所述特异性探针为长度20
‑
50nt的单链DNA，与所述靶核糖体RNA的cDNA序列严格互补配对(完全互补配对)，且与所述靶核糖体RNA以外的其他RNA对应的cDNA序列不存在连续超过15nt的互补配对；且所述特异性探针的3
’
末端进行封闭。
[0012]在本专利技术的具体实施方式中，所述特异性探针的3
’
末端通过NH2C6修饰实现封闭。
[0013]进一步地，所述特异性探针的脱氧核糖核苷酸可包括一种或多种修饰，每种修饰的数量可为一个或多个。
[0014]更进一步地，所述修饰的种类可选自如下：PNA、C3 Spacer、LNA、dU、MGB(核酸小沟嵌合物)、2
‑
O
‑
甲基核糖、5
‑
羟基丁酸酰基
‑
脱氧尿苷、2
‑
氨基脱氧腺苷、5
‑
甲基脱氧胞苷。
[0015]进一步地，所述特异性探针的Tm值在70℃
‑
85℃之间。
[0016]本专利技术中，对所述特异性探针进行修饰的主要目的是使得所述特异性探针的Tm值在70℃
‑
85℃之间(探针的Tm值需要高于引物的Tm值，这样有利于探针优先结合到目的序列，温度范围的控制有利于控制多条探针的统一反应条件)。
[0017]在所述方法中，可根据所述靶核糖体RNA的长度设计多条所述特异性探针。
[0018]具体规则如下：
[0019]序列选择：选择目标基因的特异区域作为探针的靶序列。靶序列应该具有较高的特异性，不与其他基因或序列发生交叉杂交。
[0020]长度选择：探针的长度应该适当，通常在20
‑
50个核苷酸。过短的探针可能导致特异性降低，而过长的探针可能导致杂交效率降低。
[0021]碱基组成：探针的碱基组成应该均匀分布，避免出现过多的GC或AT碱基，以免影响杂交效率。
[0022]末端设计：探针的末端应该设计成稳定的结构，避免末端的不稳定性导致杂交效率降低。
[0023]在本专利技术的具体实施方式中，所述RNA
‑
seq为人、小鼠和/或大鼠的RNA
‑
seq。
[0024]相应地，所述特异性探针有21条，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1至SEQ IDNo.21所示。
[0025]进一步地，SEQ ID No.1所示探针的第19位、第23位、第32位、第35位经LNA修饰，第40位经NH2C6修饰；
[0026]进一步地，SEQ ID No.2所示探针的第3位、第7位、第20位、第24位、第32位经LNA修饰，第40位经NH2C6修饰；
[0027]进一步地，SEQ ID No.3所示探针的第8位、第14位、第18位、第32位经LNA修饰，第40位经NH2C6修饰；
[0028]进一步地，SEQ ID No.4所示探针的第27位经LNA修饰，第33位经NH2C6修饰；
[0029]进一步地，SEQ ID No.5所示探针的第16位、第22位、第26位、第31位经LNA修饰，第38位经NH2C6修饰；
[0030]进一步地，SEQ I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在RNA
‑
seq中去除核糖体RNA的方法，包括如下步骤：利用特异性探针阻断靶核糖体RNA的cDNA扩增，实现去除所述靶核糖体RNA的污染。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述特异性探针为长度20
‑
50nt的单链DNA，与所述靶核糖体RNA的cDNA序列严格互补配对，并且与所述靶核糖体RNA以外的其他RNA对应的cDNA序列不存在连续超过15nt的互补配对；且所述特异性探针的3
’
末端进行封闭。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述特异性探针的3
’
末端通过NH2C6修饰实现封闭。4.根据权利要求1
‑
3中任一所述的方法，其特征在于：所述特异性探针的脱氧核糖核苷酸包括一种或多种修饰，每种修饰的数量为一个或多个；进一步地，所述修饰的种类选自如下：PNA、C3 Spacer、LNA、dU、MGB、2
‑
O
‑
甲基核糖、5
‑
羟基丁酸酰基
‑
脱氧尿苷、2
‑
氨基脱氧腺苷、5
‑
甲基脱氧胞苷。5.根据权利要求1
‑
4中任一所述的方法，其特征在于：所述特异性探针的Tm值在70℃
‑
85℃之间。6.根据权利要求1
‑
5中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，根据所述靶核糖体RNA的长度设计多条所述特异性探针。7.根据权利要求1
‑
6中任一所述的方法，其特征在于：所述RNA
‑
seq为人、小鼠和/或大鼠的RNA
‑
seq；所述特异性探针有21条，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1至SEQ ID No.21所示；进一步地，SEQ ID No.1所示探针的第19位、第23位、第32位、第35位经LNA修饰，第40位经NH2C6修饰；进一步地，SEQ ID No.2所示探针的第3位、第7位、第20位、第24位、第32位经LNA修饰，第40位经NH2C6修饰；进一步地，SEQ ID No.3所示探针的第8位、第14位、第18位、第32位经LNA修饰，第40位经NH2C6修饰；进一步地，SEQ ID No.4所示探针的第27位经LNA修饰，第33位经NH2C6修饰；进一步地，SEQ ID No.5所示探针的第16位、第22位、第26位、第31位经LNA修饰，第38位经NH2C6修饰；进一步地，SEQ ID No.6所示探针的第17位、第22位、第27位、第32位经LNA修饰，第38位经NH2C6修饰；进一步地，SEQ ID No.7所示探针的第11位、第18位、第24位经LNA修饰，第40位经NH2...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄莹莹，张帆，郭小蛟，田庚，杨洋，
申请(专利权)人：简石生物技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：