检测牛细小病毒3型的实时PCR方法技术

本发明专利技术提供了用于检测测试样本的经提取的DNA中的牛细小病毒3型(BPV

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测牛细小病毒3型的实时PCR方法
[0001]本申请要求2020年12月17日提交的美国临时申请号63/126,939和2021年6月17日提交的美国临时申请号63/211,607的权益，将二者整体通过引用并出于所有目的特此并入，如同在本文中完全阐述本申请连同电子格式的序列表一起提交。
[0002]序列表以标题为A
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2741
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WO
‑
PCT_ST25.txt的文件提供，该文件创建于2021年12月9日，大小为6KB。电子格式的序列表中的信息通过引用以其全文并入本文。


[0003]本专利技术涉及生物药剂制造领域。具体来说，本专利技术提供了一种带有任选的内部对照的PCR测定，其用于定性或定量检测测试样本的经提取的DNA中的牛细小病毒(Bovine parvovirus)3型(BPV
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3)基因组DNA污染。

技术介绍

[0004]使用细胞培养方法制造治疗性生物学药物具有传播病毒污染物的固有风险。此类污染物可能来自多种来源，包括材料和设备、在制造期间使用动物来源的试剂、以及通过由于GMP过程中的缺失对制造系统造成的污染。动物源性原料(诸如牛血清(FBS))有时用作基于细胞培养的制造方法中的组分并且是生物制造过程中牛源性病毒污染的主要来源之一。为了符合监管卫生要求，以确保在来源于哺乳动物细胞的生物治疗药中不含外源因子，生物制造商需要采取措施检测、去除和/或灭活病毒污染。可以在使用前对原料测试病毒污染并采取补救措施。根据正在制造的生物分子，可以为下游纯化工艺增设专门的病毒灭活和去除步骤以确保生物治疗药的病毒安全性。
[0005]细小病毒科(Parvoviridae)包括单链DNA(ssDNA)病毒，其衣壳较小、无包膜，呈T＝1二十面体对称，这些病毒统称为细小病毒。其直径范围介于18
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26nm之间。病毒衣壳包裹一个约5kb的基因组，该基因组编码两种主要的蛋白质，即非结构(NS)蛋白和结构衣壳(VP)蛋白。细小病毒科病毒感染多种宿主且分为两个亚科：细小病毒亚科(Parvovirinae)和浓病毒亚科(Densovirinae)，二者分别感染脊椎动物和节肢动物宿主。
[0006]牛细小病毒3型(BPV
‑
3)属于细小病毒亚科、红细胞细小病毒(Erythroparvovirus)属(有蹄类红细胞细小病毒(Ungulate erythroparvovirus)1型物种)。尽管已知BPV
‑
3感染牛类，但其发病机制和临床表现仍不清楚。
[0007]根据美国联邦法规中的测试要求(9CFR113)，需要通过以下方式来评估在生物制剂生产中使用的动物源性成分中是否存在某些病毒：在特定指示细胞上孵育动物源性原料，且随后观察病毒诱发的细胞病变效应并通过血细胞吸附或抗体荧光进行测试。在牛细小病毒中，BPV
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1能够在至少一种选定的指示细胞系中复制并且可以通过9CFR 113测试来检测。
[0008]然而，迄今为止尚未确定支持BPV
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3复制的允许细胞系(permissive cell line)，因此，无法通过常规9CFR 113测试来检测BPV
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3。尽管数年前已通过下一代测序(NGS)检测BPV
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3，但它仍是一种可获得信息有限的新兴病毒。传统的基于细胞培养的病毒测试不能够
证实BPV
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3复制，因此，分子生物学测定是检测BPV
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3基因组DNA的必要替代方法。BPV
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3在基于细胞培养的制造中的影响尚不清楚。需要一种快速且特异的方法来检测在诸如胎牛血清(FBS)等原料和/或来自基于细胞培养的制造的含有FBS的未处理非GMP批量收获物样本中是否存在BPV
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3基因组DNA。本文所描述的专利技术满足了该需要。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供了一种组合物，其包含选自由以下各项组成的组的寡核苷酸：a)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核酸序列的寡核苷酸；b)具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核酸序列的寡核苷酸；c)具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核酸序列的寡核苷酸；d)具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核酸序列的寡核苷酸；以及e)具有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15的核酸序列的寡核苷酸；f)具有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的核酸序列的寡核苷酸；g)具有SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的核酸序列的寡核苷酸；以及h)具有SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的核酸序列的寡核苷酸。在一个实施例中，该组合物任选地包含第二组合物，该第二组合物包含具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的序列的寡核苷酸。在一个实施例中，该组合物包含具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核酸序列的寡核苷酸。在一个实施例中，该组合物包含第一组合物以及第二组合物，该第一组合物包含具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核酸序列的寡核苷酸，该第二组合物包含具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的序列的寡核苷酸。
[0010]本专利技术提供了一种用于检测测试样本的经提取的DNA中的牛细小病毒3型(BPV
‑
3)基因组DNA的编码DNA的试剂，该试剂选自由以下各项组成的组：a)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核酸序列的引物探针组合；b)具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核酸序列的引物探针组合；c)具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核酸序列的引物探针组合；d)具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核酸序列的引物探针组合；以及e)具有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15的核酸序列的引物探针组合；f)具有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的核酸序列的引物探针组合；g)具有SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的核酸序列的引物探针组合；以及h)具有SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的核酸序列的引物探针组合。
[0011]在一个实施例中，SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，该组合物包含选自由以下各项组成的组的寡核苷酸：a)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核酸序列的寡核苷酸；b)具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核酸序列的寡核苷酸；c)具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核酸序列的寡核苷酸；d)具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核酸序列的寡核苷酸；e)具有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的核酸序列的寡核苷酸；f)具有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的核酸序列的寡核苷酸；g)具有SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的核酸序列的寡核苷酸；以及h)具有SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的核酸序列的寡核苷酸。2.根据权利要求1所述的组合物，其中该组合物任选地包含第二组合物，该第二组合物包含具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的序列的寡核苷酸。3.根据权利要求1所述的组合物，其中该组合物包含具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核酸序列的寡核苷酸。4.根据权利要求1所述的组合物，其中该组合物包含第一组合物以及第二组合物，该第一组合物包含具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核酸序列的寡核苷酸，该第二组合物包含具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的序列的寡核苷酸。5.一种试剂，该试剂用于检测测试样本的经提取的DNA中的牛细小病毒3型(BPV
‑
3)基因组DNA，该试剂选自由以下各项组成的组：a)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核酸序列的引物探针组合；b)具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核酸序列的引物探针组合；c)具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核酸序列的引物探针组合；d)具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核酸序列的引物探针组合；e)具有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的核酸序列的引物探针组合；f)具有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的核酸序列的引物探针组合；g)具有SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的核酸序列的引物探针组合；以及h)具有SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的核酸序列的引物探针组合。6.根据权利要求5所述的试剂，其中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:28具有荧光报告染料和/或非荧光淬灭剂。7.根据权利要求5所述的试剂，其中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:28中的一者或多者在5
’
末端具有荧光报告染料6
‑
羧基荧光素(FAM)且/或在3
’
末端具有小沟结合剂
‑
非荧光淬灭剂(MGB
‑
NFQ)或者具有ZEN
‑
IB与Iowa Black荧光淬灭剂(IBFQ)。8.根据权利要求5所述的试剂，其中该引物探针组合检测该测试样本中的编码牛细小病毒3型的结构衣壳(VP)蛋白和/或非结构(NS)蛋白的DNA。9.根据权利要求5所述的试剂，该试剂与内部阳性对照引物组合联合使用。10.根据权利要求5所述的试剂，该试剂包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。
11.一种试剂，该试剂在用于检测测试样本的经提取的DNA中的牛细小病毒3型(BPV
‑
3)基因组DNA的测定中用作内部阳性对照引物探针组合，该试剂包含引物探针组合。12.根据权利要求11所述的试剂，其中该引物探针组合具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的核酸序列。13.根据权利要求11所述的试剂，其中SEQ ID NO:18具有荧光报告染料和/或非荧光淬灭剂。14.根据权利要求13所述的试剂，其中SEQ ID NO:18在5
’
末端具有荧光报告染料2
’‑
氯
‑7’
苯基
‑
1,4
‑
二氯
‑6‑
羧基
‑
荧光素(VIC)并且在3
’
末端具有小沟结合剂
‑
非荧光淬灭剂(MGB
‑
NFQ)。15.一种引物探针组合，该引物探针组合用于检测测试样本的经提取的DNA中的牛细小病毒3型基因组DNA，其与用于检测牛细小病毒3型(BPV
‑
3)基因组DNA的内部阳性对照引物探针组合联合使用。16.根据权利要求15所述的用于检测牛细小病毒3型基因组DNA的引物探针组合，其中该引物探针组合选自由以下各项组成的组：a)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核酸序列的引物探针组合；b)具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核酸序列的引物探针组合；c)具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核酸序列的引物探针组合；d)具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核酸序列的引物探针组合；e)具有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的核酸序列的引物探针组合；f)具有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的核酸序列的引物探针组合；g)具有SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的核酸序列的引物探针组合；以及h)具有SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的核酸序列的引物探针组合。17.根据权利要求16所述的引物探针组合，其中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15具有荧光报告染料和/或非荧光淬灭剂。18.根据权利要求16所述的引物探针组合，其中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:28中的一者或多者在5
’
末端具有荧光报告染料6
‑
羧基荧光素(FAM)且/或在3
’
末端具有小沟结合剂
‑
非荧光淬灭剂(MGB
‑
NFQ)或者具有ZEN
‑
IB与Iowa Black荧光淬灭剂(IBFQ)。19.根据权利要求15所述的引物探针组合，其中该引物探针组合检测测试样本中的编码牛细小病毒3型的结构衣壳(VP)蛋白和/或非结构(NS)蛋白的DNA。20.根据权利要求15所述的用于检测测试样本中的牛细小病毒3型(BPV
‑
3)基因组DNA的内部阳性对照引物探针组合，其中该引物探针组合具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的核酸序列。21.根据权利要求20所述的内部阳性对照引物探针组合，其中SEQ ID NO:18具有荧光报告染料和/或非荧光淬灭剂。22.根据权利要求20所述的引物探针组合，其中SEQ ID NO:18在5
’
末端具有荧光报告染料2
’‑
氯
‑7’
苯基
‑
1,4
‑
二氯
‑6‑
羧基
‑
荧光素(VIC)并且在3
’
末端具有小沟结合剂
‑
非荧光淬灭剂(MGB
‑
NFQ)。
23.一种引物探针组合，该引物探针组合用于检测测试样本的经提取的DNA中的牛细小病毒3型基因组DNA，该引物探针组合包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，其与包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的内部阳性对照引物探针组合联合使用，其中SEQ ID NO:9在5
’
末端具有荧光报告染料6
‑
羧基荧光素并且在3
’
末端具有小沟结合剂
‑
非荧光淬灭剂(MGB
‑
NFQ)非荧光淬灭剂，并且SEQ ID NO:18在5
’
末端具有荧光报告染料2
’‑
氯
‑7’
苯基
‑
1,4
‑
二氯
‑6‑
羧基
‑
荧光素并且在3
’
末端具有小沟结合剂
‑
非荧光淬灭剂(MGB
‑
NFQ)。24.一种试剂盒，该试剂盒用于检测测试样本的经提取的DNA中的牛细小病毒3型(BPV
‑
3)基因组DNA污染，其包括检测编码BPV
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3的DNA的引物探针组合，该引物探针组合选自由以下各项组成的组：a)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核酸序列的引物探针组合；b)具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核酸序列的引物探针组合；c)具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核酸序列的引物探针组合；d)具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：美国安进公司，
类型：发明
国别省市：