用于膀胱癌早期筛查的引物、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于膀胱癌早期筛查的引物、试剂盒及应用，通过算法筛选出可疑的高频膀胱癌基因片段，根据MethPrimers设计各个目的基因片段的甲基化引物。通过提取T24膀胱癌细胞中DNA，进行甲基化处理，模拟实验流程，验证所设计的引物可行性和准确性。并确定灵敏度和特异性相对较高的8对引物及一对内参引物；通过对100例样本(70例膀胱癌患者和30例正常人)进行提取尿液DNA，甲基化处理，qPCR定量处理，回归分析，验证确认的引物在膀胱癌诊断中的价值。得到的引物具有稳定可靠且通过联检具有高灵敏度与特异性。只需要几滴尿液，随机尿当下立刻即取，检测时间短。检测时间短。检测时间短。

【技术实现步骤摘要】
用于膀胱癌早期筛查的引物、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及的是一种用于膀胱癌早期筛查的引物、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]目前针对膀胱的检查方法主要有尿液检查、影像学检查、膀胱镜检查等，尿液检查中，尿常规检查可早期发现镜下血尿(但是灵敏度、特异度低)，尿脱落细胞检查可检测肿瘤细胞(特异度高)，但操作耗费时间长，开展较少，易于漏检早期肿瘤；影像学检查包括超声检查、X线造影、CT等CT尿路造影对于评估疾病分期有着不可替代的作用，但此类方法对较小的肿瘤不够灵敏，无法进行明确诊断；膀胱镜检查是目前诊断膀胱癌的可靠方法，活检病理结果是诊断膀胱癌的金标准，膀胱镜通过尿路进入膀胱，进行可视化观察，发现早期肿瘤并取样活检，但方法是一种有创操作，会造成身体不适，且经济负担较重。因此有必要开发一种无创的可靠的新型膀胱癌标识物和检测技术，提高膀胱癌早癌检出率，改善膀胱癌治疗效果，降低膀胱癌死亡率。
[0003]表观遗传学是近年来肿瘤研究的热点领域，DNA的甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA调控等表观遗传学改变都被认为与肿瘤的发生有着密切关系，其中DNA的甲基化是最为常见的表观遗传学改变，其可调控细胞增殖、凋亡与分化，且水平与肿瘤的生物学特性密切相关。目前研究表明，涉及多种癌基因和抑癌基因的异常甲基化，其中大多数异常甲基化为抑癌基因的高甲基化，高甲基化往往导致抑癌基因的转录沉默。DNA甲基化异常通常贯穿癌症的发生和发展过程，因此DNA甲基化指标的检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标。
[0004]针对DNA甲基化检测方法大致可分为两类：全基因组甲基化分析和特异位点甲基化检测。全基因组甲基化分析检测成本较高，常作为一种高通量的筛选发现目标基因的手段；特异位点甲基化检测方法有联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR法(MSP)、甲基化荧光定量法(MethyLight)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法等，限制性内切酶分析法只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，甲基化特异性PCR法基于普通PCR及电泳分析操作繁琐且易造成样品污染，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法对仪器要求较高，需要带高分辨率熔解(HRM)模块的荧光定量PCR仪，甲基化荧光定量法基于其高通量和高灵敏性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差，在DNA甲基化的检测中应用广泛。目前基于甲基化荧光定量法检测膀胱癌DNA甲基化方法中针对单个基因的检测精准度未如理想，诊断效果有限。
[0005]因此，现有技术存在缺陷，有待改进与发展。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种用于膀胱癌早期筛查的引物、试剂盒及应用，旨在通过提供一种稳定可靠且具有高灵敏度与特异性的
无创的膀胱癌检测方法。
[0007]本专利技术解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0008]第一方面，用于膀胱癌基因甲基化检测位点，其中，所述的基因甲基化检测位点包括：SHANK2、RAI1、TNK1和IFF01。
[0009]第二方面，用于上述所述的膀胱癌基因甲基化检测位点的PCR引物，其中，所述SHANK2甲基化检测位点的PCR引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物、如SEQ ID NO.2所示的下游引物；
[0010]所述RAI1甲基化检测位点的PCR引物包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物、如SEQ ID NO.4所示的下游引物；
[0011]所述TNK1甲基化检测位点的PCR引物包括如SEQ ID NO.5所示的上游引物、如SEQ ID NO.6所示的下游引物；
[0012]所述IFF01甲基化检测位点的PCR引物包括如SEQ ID NO.7所示的上游引物、如SEQ ID NO.8所示的下游引物。
[0013]以下作为本专利技术的优选技术方案，但不作为对本专利技术提供的技术方案的限制，通过以下优选的技术方案，可以更好的达到和实现本专利技术的目的和有益效果。
[0014]作为优选的技术方案，所述的用于膀胱癌基因甲基化检测的PCR引物，其中，还包括括检测内参基因ALU
‑
C4的PCR引物，所述引物包括如SEQ ID NO.9所示的上游引物、如SEQ ID NO.10所示的下游引物。
[0015]第三方面，一种膀胱癌基因甲基化检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述所述的PCR引物，还包括阳性质控品以及阴性质控品。
[0016]作为优选的技术方案，所述的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒，其中，所述膀胱癌基因甲基化检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1
‑
1μM PCR引物。
[0017]作为优选的技术方案，所述的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒，其中，所述阳性质控品为亚硫酸氢盐修饰的全甲基化人类基因组DNA；所述阴性质控品为亚硫酸氢盐修饰的非甲基化人类基因组DNA。
[0018]第四方面，膀胱癌基因甲基化检测方法，其中，包括：
[0019]对待测的生物样品进行分离，得到目标DNA；
[0020]对所述目标DNA进行亚硫酸氢盐转化处理，得到亚硫酸氢盐转化的DNA；
[0021]采用甲基化荧光定量PCR技术检测所述DNA的甲基化状态，得到测试结果。
[0022]作为优选的技术方案，所述的膀胱癌基因甲基化检测方法，其中，所述目标DNA总量>500纳克，片段大小>5kb。
[0023]作为优选的技术方案，所述的膀胱癌基因甲基化检测方法，其特征在于，所述生物样品包括：尿液和组织。
[0024]作为优选的技术方案，所述的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒在制备膀胱癌早期筛查试剂中的应用。
[0025]有益效果：与现有技术相比，本专利技术所提供的用于膀胱癌早期筛查的试剂盒，具有稳定可靠且通过联检具有高灵敏度与特异性。只需要几滴尿液，随机尿当下立刻即取，检测时间短。
附图说明
[0026]图1是本专利技术提供的膀胱癌基因甲基化检测的构建流程示意图；
[0027]图2是使用napdrop检测DNA浓度结果示意图；
[0028]图3为待测DNA完整性检测结果；
[0029]图4为内参基因和筛选的目的基因的电泳图，其中marker为5kb，左边红色框出内参ALU,右边黑色框出8个目的基因，从左往右依次是：ALU(内参)，RAI1(1号)，TNK1(2号)，SEPTIN9(3号)，ZNF808(4号)，SHANK2(5号)，TMEM106A(7号)，IFFO1(9号)，RAPGEFL1(10号)；
[0030]图5为8个目的基因在100例样本(70例膀胱癌患者和30例健康人)的RLM；
[0031]图6为RAI1
‑
F的标准曲线和TNK1的标准曲线；
[0032]图7为SEPTIN9的标准曲线和TNK1的标准曲线；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于膀胱癌基因甲基化检测位点，其特征在于，所述的基因甲基化检测位点包括：SHANK2、RAI1、TNK1和IFF01。2.用于权利要求1所述的膀胱癌基因甲基化检测位点的PCR引物，其特征在于，所述SHANK2甲基化检测位点的PCR引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物、如SEQ ID NO.2所示的下游引物；所述RAI1甲基化检测位点的PCR引物包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物、如SEQ ID NO.4所示的下游引物；所述TNK1甲基化检测位点的PCR引物包括如SEQ ID NO.5所示的上游引物、如SEQ ID NO.6所示的下游引物；所述IFF01甲基化检测位点的PCR引物包括如SEQ ID NO.7所示的上游引物、如SEQ ID NO.8所示的下游引物。3.根据权利要求2所述的用于膀胱癌基因甲基化检测的PCR引物，其特征在于，还包括检测内参基因ALU
‑
C4的PCR引物，所述引物包括如SEQ ID NO.9所示的上游引物、如SEQ ID NO.10所示的下游引物。4.一种膀胱癌基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴松，夏路，王书鹏，雷崎方，方虎，曾钦龙，
申请(专利权)人：深圳大学附属华南医院，
类型：发明
国别省市：