基于纳米孔测序的呼吸道样品快速检测panel制造技术

本发明专利技术提供了一种基于纳米孔测序的呼吸道样品快速检测panel，包括检测16sRNA基因、recA基因、gyrB基因、hsp60基因、pgp3基因、rpoB基因、nucleoprotein基因、fusion glycoprotein基因、nucleocapsid phosphoprotein基因、VP2基因的引物。还提供了一种检测呼吸道病原体的试剂盒，包括检测上述基因的引物。本发明专利技术将纳米孔测序结合优化的panel组合能够提高检测的灵敏度、准确性和可靠性，为基因组学研究、临床诊断和个体化治疗等领域提供了有效的技术支持。等领域提供了有效的技术支持。等领域提供了有效的技术支持。

【技术实现步骤摘要】
基于纳米孔测序的呼吸道样品快速检测panel


[0001]本专利技术属于生物医学领域，涉及一种检测panel，具体来说是一种基于纳米孔测序的呼吸道样品快速检测panel。

技术介绍

[0002]呼吸道感染是一种常见的疾病，包括感冒、流感、肺炎等等。这些感染可导致症状如咳嗽、喉咙痛、呼吸急促、发热等等，严重时甚至会危及生命。根据世界卫生组织(WHO)的数据，呼吸道感染是全球十大死亡原因之一，其中肺炎是造成儿童死亡的主要原因之一。每年大约有3.34亿人发生重症呼吸道感染，其中5％至10％需要住院治疗。因此，针对呼吸道感染做出迅速和准确的诊断至关重要，因为许多疾病具有相似的症状，而不同的病原微生物引发的疾病需要不同的治疗方案。
[0003]传统的诊断方法如(1)细菌培养方法，需要进行培养和细菌学分析，时间较长，一般需要等待数天才能得到结果；(2)传统的免疫学检测方法：如ELISA(酶联免疫吸附试验)和放射免疫测定法(RIA)，可以检测某些呼吸道病原体的抗原或抗体，这种方法简单易行，但灵敏度和特异性相对较低；(3)传统的PCR(聚合酶链式反应)方法：这种方法可以检测细菌和病毒等多种呼吸道病原体，具有高灵敏度和特异性。
[0004]但是，仍旧面临以下几个问题：
[0005]特异性问题：由于PCR方法检测的是特定的序列，因此如果病原体突变或者存在多种亚型，该方法可能无法检测到。
[0006]准确性问题：PCR方法在理论上可以非常灵敏地检测到非常小的目标序列，但在实际应用中，可能会受到许多因素的影响，如样本制备、PCR扩增条件等，从而导致假阳性或假阴性的结果产生。
[0007]样品损害问题：在PCR方法中，需要对样品进行处理以提取其中的核酸，这个过程可能会造成样品中的病原体微生物被破坏或者丢失，从而影响检测的灵敏度和特异性。
[0008]成本问题：相比于传统的诊断方法，PCR方法需要更高的技术和设备要求，并且需要购买高质量的试剂和耗材，因此成本较高。
[0009]时间问题：虽然PCR方法可以在短时间内得到结果，但是相比于快速诊断方法(如RDTs)，PCR方法可能需要更长时间的实验操作和分析，因此可能无法满足紧急诊断的要求。
[0010]此外，由于病原体的多样性和变异性，使用以上传统的方法有时难以鉴别不同类型的感染，或者可能会出现假阴性或假阳性的结果，这将导致错误的诊断和治疗选择。因此，开发快速、准确地诊断呼吸道样品病原微生物快速检测技术显得尤为迫切，现阶段纳米孔检测技术作为一种新兴的高通量单分子检测技术，具有高灵敏度、高特异性、快速分析等优点。与传统扩增测序技术相比，纳米孔检测技术可以避免PCR扩增和文库构建过程中的偏差、误差、假阳性和假阴性等问题，从而提高结果的可靠性和准确性。
[0011]结合panel引物设计进行靶向扩增可以进一步提高靶向区域的覆盖率和扩增效率。好的panel引物设计可以利用已知基因信息，准确选择目标靶向区域并设计高效特异的
引物，从而实现对目标区域的高度靶向扩增。在靶向扩增的同时，也避免了无关片段的扩增和干扰。通过结合纳米孔检测技术和优化的panel引物设计进行靶向扩增，可以实现高通量、高准确性、高覆盖率、高特异性的单分子检测。该技术具有广泛的应用前景，对呼吸道感染中的精准快速医学和个体化治疗提供有力支持。
[0012]纳米孔测序技术是一种基于纳米孔的高通量测序技术，其基本原理是利用纳米孔，将单个DNA或RNA分子经过电场的作用通过纳米孔，同时检测引起的电信号变化，从而得到单个分子的测序信息(图一)。在纳米孔测序中，DNA/RNA样品被加工成具有特定结构的适配体，然后加入到含有纳米孔的微小孔径中。当DNA/RNA分子穿过纳米孔时，它会引起微小的电导率变化，这些变化可被检测并记录下来。通过识别和记录这些不同的电信号和衰减速度，可以推断出每个碱基，进而得到整个DNA/RNA分子的序列。
[0013]Panel的设计优化，离不开标志基因的挑选，当前，利用16S rRNA进行微生物分类和多样性研究的方法已经被广泛采用。然而，16S rRNA在一些微生物中的丰度较低，或者由于覆盖区间重叠太广无法区分物种，因此需要寻找类似16S的保守基因作为替代靶向扩增对象。细菌基因组中除了16S rRNA之外，还有许多其他可用于微生物分类和多样性研究的保守基因。这些基因包括但不限于：18S rRNA(真核生物)、23S rRNA、ITS(内转录间隔区)、recA、gyrB、hsp60等。每个基因都有其独特的特点和应用范围。其中，gyrB基因(DNA gyrase subunit B)是细菌中广泛存在的一种高度保守的基因，在微生物分类和多样性研究中也被经常使用。与16S rRNA相比，gyrB基因的序列变异较小，因此能够提供更高的分辨率和进化信息。同时，gyrB基因在传统靶向扩增方法中也具有较高的扩增效率和特异性。

技术实现思路

[0014]针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种基于纳米孔测序的呼吸道样品快速检测panel，所述的这种基于纳米孔测序的呼吸道样品快速检测panel要解决现有技术中的方法检测呼吸道感染病原体可能会出现假阴性或假阳性概率高的技术问题。
[0015]本专利技术提供了一种基于纳米孔测序的呼吸道样品快速检测panel，包括检测16sRNA基因、recA基因、gyrB基因、hsp60基因、pgp3基因、rpoB基因、nucleoprotein基因、fusion glycoprotein基因、nucleocapsid phosphoprotein基因、VP2基因的引物。
[0016]进一步的，检测16sRNA基因的引物，其上游引物序列为
[0017]agagtttgatcctggctcag，下游引物序列为ttactcacccgtccgccttgact；检测recA基因的引物，其上游引物序列为gatcgaraagcagttcggcaa，下游引物序列为ttgtccttgccctgrccgat；检测gyrB基因的引物，其上游引物序列为agtcgttgtgaacaaggctgtgtcc，下游引物序列为
[0018]acatacagttcggacttgcgcggat；检测hsp60基因、的引物，其上游引物序列为gactacgaccgtgagaagct，下游引物序列为gagttgaaggcgatctgctt；检测pgp3基因的引物，其上游引物序列为agtgttgtttacagccgttctc，下游引物序列为acaattacacccgacaacgtt；检测rpoB基因、的引物，其上游引物序列为aacatcgtacccgtcgtagtt，下游引物序列为gaaccatagcccaccttacc；检测nucleoprotein基因、其上游引物序列为caatgtgacggacacagcaa，下游引物序列为tcttgttgtcccgatcagca；检测fusion glycoprotein基因、的引物，其上游引物序列为ctcatgc本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米孔测序的呼吸道样品快速检测panel，其特征在于：包括检测16sRNA基因、recA基因、gyrB基因、hsp60基因、pgp3基因、rpoB基因、nucleoprotein基因、fusion glycoprotein基因、nucleocapsid phosphoprotein基因、VP2基因的引物。2.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序的呼吸道样品快速检测panel，其特征在于：检测16sRNA基因的引物，其上游引物序列为agagtttgatcctggctcag，下游引物序列为ttactcacccgtccgccttgact；检测recA基因的引物，其上游引物序列为gatcgaraagcagttcggcaa，下游引物序列为ttgtccttgccctgrccgat；检测gyrB基因的引物，其上游引物序列为agtcgttgtgaacaaggctgtgtcc，下游引物序列为acatacagttcggacttgcgcggat；检测hsp60基因、的引物，其上游引物序列为gactacgaccgtgagaagct，下游引物序列为gagttgaaggcgatctgctt；检测pgp3基因的引物，其上游引物序列为agtgttgtttacagccgttctc，下游引物序列为acaattacacccgacaacgtt；检测rpoB基因、的引物，其上游引物序列为aacatcgtacccgtcgtagtt，下游引物序列为gaaccatagcccaccttacc；检测nucleoprotein基因、其上游引物序列为caatgtgacggacacagcaa，下游引物序列为tcttgttgtcccgatcagca；检测fusionglycoprotein基因、的引物，其上游引物序列为ctcatgcaaagcacaccacc，下游引物序列为ggcgattgcagatccaacac；检测nucleocapsid phosphoprotein基因、的引物，其上游引物序列为aattcgtggtggtgacggta，下游引物序列为agttgtagcacgattgcagc；检测VP2基因的引物，其上游引物序列为ggtactaatgagcccgatgag，下游引物序列为gagttgtaggcgcaccatta。3.一种将权利要求1所述的panel用于制备检测呼吸道病原体的试剂中的应用。4.一种检测呼吸道病原体的试剂盒，其特征在于，包括检测16sRNA基因的引物，其上游引物序列为agagtttgatcctggctcag，下游引物序列为ttactcacccgtccgccttgact；检测recA基因的引物，其上游引物序列为gatcgaraagcagttcggcaa，下游引物序列为ttgtccttgccctgrccgat；检测gyrB基因的引物，其上游引物序列为agtcgttgtgaacaaggctgtgtcc，下游引物序列为acatacagttcggacttgcgcggat；检测hsp60基因、的引物，其上游引物序列为gactacgaccgtgagaagct，下游引物序列为gagttgaaggcgatctgctt；检测pgp3基因的引物，其上游引物序列为agtgttgtttacagccgttctc，下游引物序列为acaattacacccgacaacgtt；检测rpoB基因、的引物，其上游引物序列为aacatcgtacccgtcgtagtt，下游引物序列为gaaccatagcccaccttacc；检测nucleoprotein基因、...

【专利技术属性】
技术研发人员：范列英，李根，付爱思，叶杨芹，宗明，李强，孙禾，申志勇，庞斌，
申请(专利权)人：武汉臻熙医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：