本发明专利技术涉及重度妊娠期高血压生化标记物的质谱试剂盒及制备方法，属于蛋白质检测技术领域。由磁珠、粘合液、清洗液、洗提液、稳定剂等组成，从复杂生物样品中富集和纯化多肽和蛋白。试剂盒包括一小管粘合液；一小管磁珠；一小管清洗液；一小管洗提液；一小管能量吸收分子饱和溶液的稳定剂，上述各小管置于４℃冷藏盒中。本发明专利技术可用于体外样品检测和预后判断的质谱试剂盒。所述试剂盒对重度妊娠期高血压判断的几个特征蛋白峰为２７７１、３２１８、３８８７、４１９２、４２１０、５１０１和５６８９Ｄａ。本方法准确、方便且快捷。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质检测
，特别涉及基于质谱技术的用于对重度妊娠高血 压生物样品中生化标记物分析的试剂盒制备方法，从复杂生物样品中富集和纯化重度妊娠 高血压中的新型生化标记物。
技术介绍
不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白 质功能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及筛查，并最终 用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨 细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白 的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行鉴定分析。用质谱联合可克服这 一技术缺点。妊娠高血压疾病妊娠是特有的，表现为妊娠20周后出现血压升高、尿蛋白及全身 各脏器功能紊乱的疾病综合征。重度子痫前期的发病率3_5%，是引起围产期母儿不良妊 娠结局的主要疾病之一。近年来的新研究方法包括蛋白组学、基因组学、脂质组学、mRNA 微阵列技术等，从分子学水平，深入研究妊娠高血压疾病的发病机制，有望找到妊娠高血压 疾病特异生化指标，成为早期诊断、监测病情及判断疾病预后的依据。蛋白质组学是研究基 因组在不同时间和空间编码的全部蛋白质的组成及作用规律，在组织细胞的整体蛋白质水 平上揭示生命活动的基本规律，获得对细胞生理、病理过程及调控网络的全面而深入的认 识。应用的技术平台主要有二维凝胶电泳分离技术和质谱分析技术。前者主要用于分子 量IO-IOOkD蛋白质分离，对于疏水性、低丰度、低含量的蛋白质难以检出。而质谱仪可实现 IOkD以下小分子、低含量，尤其是组织细胞内的微量调控蛋白质的分离鉴定。蛋白质指纹 图谱技术是一种新的蛋白质分离、鉴定方法。其原理是利用激光脉冲辐射使蛋白质芯片池 中的分析物解吸形成荷电离子，不同质荷比的离子在仪器场中飞行的时间长短不一，经软 件处理后，精确的绘制出蛋白质谱图。其优点是可直接从原始样品中进行捕获、检测与分 析，灵敏度高，检测范围广(500 500000)，所需样品体积小(0. 5 400 μ L)；检测简便， 整个测定过程一般为30min，且敏感性和特异性高；同时不会破坏所测定的蛋白质；结果可 靠，可重复性高。该技术不仅可筛选出与疾病相关的特异生物标志物，还可发现与疾病相关 的不同方式组合的蛋白质指纹图谱，为疾病的临床早期诊断、药靶的发现、疗效判断和预后 提供了依据。目前在进行蛋白质质谱分析时还没有发现一个用于重度妊娠高血压生化标记物 检测的标准化质谱试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服已有技术的不足之处，提出一种用于检测临床重度妊娠高血 压生化标记物的质谱试剂盒及制备方法，该试剂盒为重度妊娠高血压的早期检测提供了新3的途径，并为进一步发现新的重度妊娠高血压生物标志提供了基础。本专利技术提出的用于检测重度妊娠高血压生物标志的质谱试剂盒，其特征在于，该 试剂盒包括一小管粘合液，10 30 μ 1 ；一小管质谱标准化质控血清(浆)，10 30 μ 1 ；一小管MB-WCX磁珠或金属亲和表面(MB-IMAC Fe)磁珠30 50 μ 1 ；一小管清洗液300 500 μ 1，该清洗液为50 IOOmM PBS或NaAc，ρΗ值为4. 0 5. 0 ；。一小管洗提液10 50 μ 1，该洗提液为1 5%三氟乙酸的水溶液；一小管稳定剂5 10μ 1，该稳定剂由能量吸收分子溶解在含30 60%乙腈和 0.5 三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟 基苯甲酸之中的任一种；上述各小管置于4°C冷藏盒中。本专利技术提出的上述质谱试剂盒制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤1)含粘合液的质谱标准化质控血清(浆)的制备将男性、女性等量的0型血 清(浆)稀释在粘合液中制成质谱的标准化质控血清(浆)，加10%牛胰岛素(bovine insulin，5733Da)，并将该稀释的血清(浆)分装成10 30 μ 1小管中；其中，血清(浆) 粘合液=1 2，所述粘合液为 9Μ Urea, 2% CHAPS, 50mM Tris-HCL, ρΗ 7· 0 9· 0 ；2)将购买的 50 IOOmM PBS (Phosphate-Buffered Saline)或 NaAc，ρΗ 值为 4.0 5.0清洗液、1 5%三氟乙酸的洗提液分别分装成300 500 μ 1小管和10 50 μ 1 小管；3)将能量吸收分子溶解30 60%乙腈和0. 5 1 %三氟乙酸的水溶液中制成稳 定剂，并分装成5 10 μ 1小管，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲 酸之中的任一种；4)将上述分装好的各小管置于4°C冷藏箱中。本专利技术还提出所述的试剂盒对重度妊娠高血压生物标志的预后判断的应用。所述试剂盒依据几个特征蛋白峰为2771、3218、3887、4192、4210、5101和 5689Da(图1)，双盲测试重度妊娠高血压生物标志样品的敏感性100%，特异性为100%。质谱试剂盒检测重度妊娠高血压生物标志的应用实验步骤包括1.将生物样品先用粘合液稀释30 50倍，将样品充分混勻；2.将上述标本100 μ 1加至已装好磁珠的PCR管中，置磁性处理器上，15 25°C孵 育20 40分钟，除去液体；3.加100 μ 1清洗液至已装好磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育1 5分钟，除 去液体，重复上述操作两次；4.加10 μ 1洗提液1 5分钟，洗脱标本至上清液；5.取5 μ 1上清液移至另一个PCR管中，加入5 μ 1能量吸收分子饱和稳定剂充分 混勻；6.取1 μ 1混合溶液加样至质谱专用金属片(有3x3mm圆孔)上，自然干燥金属47.将上述金属片加入质谱仪中，就会生成质谱；8.外部使用多肽分子质量标准来校正质量精确性，所有样本均进行双份检测以减 少实验误差。上述的生物标志是利用一台质谱仪来检测的。该设备的质量精确度约为+/_1%。重度妊娠高血压生物标志首先能够被具有能与重度妊娠高血压生物标志结合的 磁珠(Magnetic Bead，简称MB，如MB_WCX、MB_IMAC Fe等品名)吸附表面捕获，非吸附物能 从磁珠上洗脱，吸附到磁珠底基的重度妊娠高血压生物标志在质谱仪中被检测。重度妊娠 高血压生物标志通过离子发生源，如激光，被离子化，产生的离子被一个离子感受集合器收 集，然后质量分析器分析那些通过的离子。之后，检测器将检测的离子信息转换为质荷比。 定量性控制及质谱激光能量调控每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血 清中用于定量的标准峰bovine insulin，5733Da强度调至50%质谱信号强度的最大值。重 度妊娠高血压生物标志的检测明显地将与信号强度的检测有关。这样，重度妊娠高血压生 物标志的数量与质量都可以被检测出来。质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱。该飞行时间谱的最终分析并不表示离子 化能量攻击一个样本产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和。这样降低了干 扰，并增加了动态范围。该飞行时间数据受数据处理软件的影响。软件中数据处理主要包 括转换飞行时间与质荷比而产生质谱，降低基线而减少仪器的偏移量，和过滤高频噪音而 减轻高频噪音。通过对重度妊娠高本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测重度妊娠期高血压生化标记物的质谱试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括： 一小管粘合液，１０～３０μｌ； 一小管质谱标准化质控血清（浆），１０～３０μｌ； 一小管ＭＢ－ＷＣＸ磁珠或金属亲和表面（ＭＢ－ＩＭＡＣ Ｆｅ）磁珠３０～５０μｌ； 一小管清洗液３００～５００μｌ，为５０～１００ｍＭ ＰＢＳ或ＮａＡｃ，ｐＨ优化值为４．０～５．０； 一小管洗提液１０～５０μｌ，该洗提液为１～５％三氟乙酸的水溶液； 一小管稳定剂５～１０μｌ，该稳定剂由能量吸收分子溶解在含３０～６０％乙腈和０．５～１％三氟乙酸的水溶液中构成，该能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羟基苯甲酸之中的任一种；上述各小管置于４℃冷藏盒中。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：边旭明，刘俊涛，许洋，
申请(专利权)人：许洋，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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