IFN-a2位点突变融合蛋白及其在制备抗呼吸道病毒免疫制剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了IFN

【技术实现步骤摘要】
IFN
‑
a2位点突变融合蛋白及其在制备抗呼吸道病毒免疫制剂中的应用


[0001]本专利技术涉及生物工程及医学
，具体涉及IFN
‑
a2位点突变融合蛋白及其在制备抗呼吸道病毒免疫制剂中的应用。

技术介绍

[0002]I型IFN是病毒感染细胞的首要响应细胞因子，具有典型的抗病毒作用。IFN
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α作为干扰素系统中最大的一类，自身还包含多种亚型，已知人类基因组含13种IFN
‑
α亚型，然而目前仅有有限的干扰素种类应用于临床。IFN
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α2作为研究最多的一个亚型，自上世纪八十年代开始，已被批准进入我国的诊疗方案之中，主要用于治疗慢性乙肝病毒感染等病毒感染所致疾病等。在HIV抗感染研究中，IFN
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α2是目前为止最为有效的抗HIV类IFN，和抗HIV药物联用能够有效的降低HIV潜伏病毒的RNA水平，有研究证实IL
‑
21和IFN
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α2联用能有效降低SIV感染的恒河猴体内的炎症水平和病毒复制，并在抗病毒药物停止后依然显著抑制SIV病毒反弹。在既往小儿合胞病毒感染研究中，在病程早期给予外源性干扰素补充是必要的，能有效增强免疫细胞清楚能力，达到控制病程进展的目的。目前，IFN
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α2在抗呼吸道病毒免疫应用中的研究较少，有进一步开发的潜力。
[0003]不同亚型的IFN
‑
α间具有较多的相似结构，同时也拥有三分之一左右的特异非保守序列，且不同亚型IFN
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α皆通过与I型IFN受体的两个不同亚基IFNAR1和IFNAR2相互作用而调控下游反应及旁路信号途径。但由于不同亚型IFN
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α间与IFNAR1和IFNAR2的结合作用力差异及结合位点不同，因此表现出了各亚型间所激活下游通路的方式与活性程度不同的特点。现有研究已基本将干扰素氨基酸序列中与干扰素受体结合相关的氨基酸位点解析，对干扰素改造研究提供了基础。通过对IFN
‑
α局部位点的突变，可改变其与IFN受体亚基间的结合能力，从而达到加强或减弱下游通路响应的效果。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供IFN
‑
a2位点突变融合蛋白及其在制备抗呼吸道病毒免疫制剂中的应用，以解决如何对IFN
‑
α局部位点的突变，可改变其与IFN受体亚基间的结合能力，从而达到加强或减弱下游通路响应的效果的问题。
[0005]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0006]本专利技术提供一种IFN
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a2位点突变融合蛋白，所述IFN
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a2位点突变融合蛋白的氨基酸序列第82位突变为E。
[0007]进一步地，在所述的IFN
‑
a2位点突变融合蛋白中，所述IFN
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a2位点突变融合蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO：1所示。
[0008]本专利技术还提供上述的IFN
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a2位点突变融合蛋白的制备方法，包括：
[0009]设计包含突变碱基的引物对对IFN
‑
a2进行PCR扩增得到IFN
‑
a2
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82E基因片段；
[0010]对所述IFN
‑
a2
‑
82E基因片段进行酶切处理，将酶切产物转化到大肠杆菌感受态
DH5α细胞中进行扩增，提取得到重组表达质粒；
[0011]将重组表达质粒转染到293t细胞，48小时培养结束后将培养液离心，去掉沉淀，并进行分离纯化结合蛋白，通过在酸性条件下洗脱结合的蛋白，再使用碱性溶液中和得到纯化后的IIFN
‑
a2位点突变融合蛋白。
[0012]进一步地，在所述的IFN
‑
a2位点突变融合蛋白的制备方法中，所述引物对的序列为：
[0013]引物F:GAAACCCTGCTGGAGAAGTTCTACACCGAGCTGTATC；
[0014]引物R:GTAGAACTTCTCCAGCAGGGTTTCGTCCCAAGCGGCGC。
[0015]进一步地，在所述的IFN
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a2位点突变融合蛋白的制备方法中，采用DpnI酶将所述IFN
‑
a2
‑
82E基因片段进行酶切处理。
[0016]进一步地，在所述的IFN
‑
a2位点突变融合蛋白的制备方法中，采用Protein G纯化柱结合蛋白。
[0017]进一步地，在所述的IFN
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a2位点突变融合蛋白的制备方法中，所述PCR扩增的条件为：。
[0018]进一步地，在所述的IFN
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a2位点突变融合蛋白的制备方法中，进行的酸性条件为：0.1M glycine，pH 2.5。
[0019]进一步地，在所述的IFN
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a2位点突变融合蛋白的制备方法中，进行的碱性条件为：1M Tris，pH 8.5。
[0020]本专利技术还提供上述的IFN
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a2位点突变融合蛋白或上述的制备方法制得的IFN
‑
a2位点突变融合蛋白在制备抗呼吸道病毒免疫制剂中的应用。
[0021]本专利技术还提供一种抗呼吸道病毒免疫制剂，包括上述的IFN
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a2位点突变融合蛋白或上述的制备方法制得的IFN
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a2位点突变融合蛋白。
[0022]本专利技术具有以下有益效果：
[0023]本专利技术提供的IFN
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a2位点突变融合蛋白，通过对IFN
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α2受体结合位点的序列改造，将IFN
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α2上一特异氨基酸位点突变为相应的IFN
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α4的氨基酸位点，并对IFN
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α2突变体进行抗病毒能力测定以及信号转导通路检测，发现相对于未突变的IFN
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α2，突变体具有更好的抗病毒能力，并且能有限降低病毒蛋白复制。
[0024]本专利技术通过对IFN
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a2的第82位氨基酸突变为E，得到IFN
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a2位点突变融合蛋白，提升其和干扰素受体亲和力，增强抗病毒能力，能有效解决制剂使用繁琐，时效性短，应用场景局限的问题，且表现出其广谱的抗病毒性，为制备新型抗呼吸道病毒免疫制剂提供思路。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：
[0026]图1为本专利技术实施例2中IFNα2
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种IFN
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a2位点突变融合蛋白，其特征在于，所述IFN
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a2位点突变融合蛋白的氨基酸序列第82位突变为E。2.根据权利要求1所述的IFN
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a2位点突变融合蛋白，其特征在于，所述IFN
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a2位点突变融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。3.一种如权利要求1或2所述的IFN
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a2位点突变融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括：设计包含突变碱基的引物对对IFN
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a2进行PCR扩增得到IFN
‑
a2
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82E基因片段；对所述IFN
‑
a2
‑
82E基因片段进行酶切处理，将酶切产物转化到大肠杆菌感受态DH5α细胞中进行扩增，提取得到重组表达质粒；将重组表达质粒转染到293t细胞，48小时培养结束后将培养液离心，去掉沉淀，并进行分离纯化结合蛋白，通过在酸性条件下洗脱结合的蛋白，再使用碱性溶液中和，得到纯化后的IFN
‑
a2位点突变融合蛋白。4.根据权利要求3所述的IFN
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a2位点突变融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述引物对的序列为：引物F:GAAACCCTGCTGGAGAAGTTCTACACCGAGCTGTATC；引物R...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨正林，何涌泉，尹燚，张易，黄璐琳，王蜀强，
申请(专利权)人：四川省医学科学院，
类型：发明
国别省市：