与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的单域抗体制造技术

本发明专利技术涉及改进的靶向SARS

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】与SARS
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CoV
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2刺突蛋白结合的单域抗体
专利

[0001]本专利技术提供改进的靶向SARS
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CoV
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2的单域抗体、所述单域抗体在治疗和/或预防冠状病毒中的用途，以及所述单域抗体在使用各种方法、测定和试剂盒检测和诊断冠状病毒中的用途。
[0002]专利技术背景
[0003]单域抗体或纳米抗体是源自骆驼科免疫球蛋白的仅重链子集的重组抗原特异性可变域(VHH)。它们的小分子尺寸、易于表达、高亲和力和稳定性相组合使它们成为独特的靶向试剂，在生物医学科学中有许多应用。纳米抗体已经成为传统抗体的替代品，用于诊断试剂的开发，并用于非侵入性生物成像。正在一些适应症中探索纳米抗体的治疗潜力，所述适应症包括肿瘤和炎症性疾病(Revets,De Baetselier等人，2005；Chanier和Chames，2019)。
[0004]最新出现的SARS
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冠状病毒2(SARS
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Cov
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2)(Zhou，Yang等人，2020)已经使注意力集中到纳米抗体在病毒学中的用途，以研究病毒的基本生物学，但也作为可能的抗病毒剂。显然，需要了解SARS
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CoV2的关键蛋白的结构
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功能关系以开发疫苗和疗法。与其他冠状病毒一样，SARS
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CoV2的单正链RNA基因组编码四种主要的结构蛋白，即刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(NP)。其中，S蛋白在病毒附着、融合和进入宿主细胞中起着关键作用，包含负责病毒受体结合的N端(S1)亚单位和介导膜融合的C端结构域(S2)(Li 2016)。SARS
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CoV2的细胞表面受体，像相关的冠状病毒SARS
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CoV一样，是血管紧张素转化酶2(ACE
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2)，已将相互作用定位到S1中的大约300个氨基酸的受体结合域(RBD)(Wan,Shang等人，2020，Yan,Zhang等人，2020)。
[0005]我们报告了通过噬菌体展示技术在体外筛选天然美洲驼VHH库，令人惊讶地鉴定了一些对RBD具有高亲和力的纳米抗体。我们已经分析了具有最高亲和力(Kd＝5.2nM)的VHH的结合性质，其阻断ACE
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2和SARS
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CoV
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2的RBD结构域之间的相互作用。
[0006]目前，对于由SARS
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CoV
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2引起的疾病COVID
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19没有治疗方法，因此存在对有效治疗方法的迫切需要。此外，需要合适的用于快速且有效地检测SARS
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CoV
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2的工具，以实现对病毒的准确诊断和监测。
[0007]专利技术概述
[0008]本专利技术提供特异性地与SARS
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CoV
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2的S蛋白的受体结合域结合的单域抗体。
[0009]第一方面，提供包含互补决定区，互补决定区3(CDR3)的单域抗体。
[0010]第二方面，提供包含CDR2和CDR3的单域抗体。
[0011]第三方面，提供包含CDR1、CDR2和CDR3的单域抗体。
[0012]另一方面，提供抗SARS
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CoV
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2单域抗体，其包含与选自以下的序列具有至少70％的同一性的氨基酸序列：SEQ 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、101、102、103、104、105、106和107。
[0013]另一方面，提供编码本专利技术的单域抗体的多核苷酸序列。
[0014]又一方面，提供本专利技术的单域抗体的亲和力成熟的突变体。
[0015]又一方面，提供用于制备本专利技术的单域抗体的方法。
[0016]又一方面，提供包含本专利技术的单域抗体的药物组合物。
[0017]又一方面，提供用于医药的本专利技术的单域抗体或本专利技术的药物组合物。
[0018]又一方面，提供用于治疗受试者中的冠状病毒的方法，其包括给予受试者治疗活性量的本专利技术的单域抗体。
[0019]又一方面，提供本专利技术的单域抗体在制备用于治疗和/或预防冠状病毒的药物中的用途。
[0020]又一方面，提供用于检测冠状病毒蛋白的方法。
[0021]又一方面，提供用于诊断受试者中的冠状病毒感染的方法。
附图说明
[0022]图1 SARS
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CoV
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2的刺突蛋白驱动感染。
[0023](a)SARS
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CoV
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2的刺突蛋白的示意图。刺突蛋白由S1和S2亚单位组成。S1结构域包含以红色突出显示的受体结合域(RBD)。使用RBD，三聚体刺突蛋白分子与人细胞上的ACE2结合。
[0024](b)SARS
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CoV
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2和SARS
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CoV
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1之间共有的RBD的选定残基以灰色突出显示(SARS
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CoV
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2)和用浅灰色文本显示(SARS
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CoV
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1)。每个序列的接触ACE2的残基用粗体突出显示。其他的序列差异以黑色文本显示，下面的冒号(：)指示保守的取代。与H11
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H4纳米抗体接触的残基被框起来。
[0025](c)骆驼科具有作为单链的二聚体的抗体。恒定区为黑色，可变区为灰色。当VHH结构域自身被表达时，它被称为纳米抗体。拓扑图显示纳米抗体由两个b片层组成。三个环—互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3—控制抗原结合，并以深灰色突出显示。
[0026]图2实验室成熟的纳米抗体以高亲和力与RBD和刺突蛋白结合。
[0027](a)通过H11的CDR3区的诱变的成熟产生了H11
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D4和H11
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H4。与母体相比的五个变化以粗体显示。
[0028](b)SPR传感图显示H11
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H4以5nM的亲和力与RBD(在芯片上作为RBD
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Fc被固定)结合。重复实验显示于图6C，H11
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D4的数据在图6D中提供。
[0029](c)RBD被ACE2(在芯片上作为ACE2
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Fc被固定)结合。当RBD与H11
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H4预先混合时，没有结合，表明H11
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H4和ACE2竞争与RBD的结合。用刺突蛋白代替RBD观察到类似的结果。抗体E08R(抗Caspr2 Fab)被用作阴性对照。图6E中提供H11
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D4的数据。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种抗SARS
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CoV
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2单域抗体，其包含选自SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的互补决定区3(CDR3)，其中CDR3的氨基酸序列包含0至7个氨基酸修饰。2.根据权利要求1所述的抗SARS
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CoV
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2单域抗体，其中所述单抗体结构域包含(a)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：3的CDR3；(b)包含SEQ ID NO：5的CDR2和包含SEQ ID NO：6的CDR3；(c)包含SEQ ID NO：8的CDR2和包含SEQ ID NO：9的CDR3；(d)包含SEQ ID NO：11的CDR2和包含SEQ ID NO：12的CDR3；(e)包含SEQ ID NO：14的CDR2和包含SEQ ID NO：15的CDR3；(f)包含SEQ ID NO：17的CDR2和包含SEQ ID NO：18的CDR3；(g)包含SEQ ID NO：20的CDR2和包含SEQ ID NO：21的CDR3；(h)包含SEQ ID NO：23的CDR2和包含SEQ ID NO：24的CDR3；(i)包含SEQ ID NO：26的CDR2和包含SEQ ID NO：27的CDR3；(j)包含SEQ ID NO：29的CDR2和包含SEQ ID NO：30的CDR3；(k)包含SEQ ID NO：32的CDR2和包含SEQ ID NO：33的CDR3；(l)包含SEQ ID NO：35的CDR2和包含SEQ ID NO：36的CDR3；(m)包含SEQ ID NO：38的CDR2和包含SEQ ID NO：39的CDR3；(n)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：40的CDR3；(o)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：41的CDR3；(p)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：42的CDR3；(q)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：43的CDR3；(r)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：44的CDR3；(s)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：45的CDR3；(t)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：46的CDR3；(u)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：47的CDR3；(v)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：48的CDR3；(w)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：49的CDR3；(x)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：50的CDR3；(y)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：51的CDR3；(z)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：52的CDR3；(aa)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：53的CDR3；(bb)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：54的CDR3；(cc)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：55的CDR3；(dd)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：56的CDR3；(ee)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：57的CDR3；(ff)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：58的CDR3；(gg)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：59的CDR3；(hh)包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：60的CDR3；其中CDR3的氨基酸序列包含0至7个氨基酸修饰，并且其中CDR2的氨基酸序列包含0至4
个氨基酸修饰。3.根据权利要求1所述的抗SARS
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CoV
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2单域抗体，其中所述单抗体结构域包含(a)包含SEQ ID NO：1的CDR1、包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：3的CDR3；(b)包含SEQ ID NO：4的CDR1、包含SEQ ID NO：5的CDR2和包含SEQ ID NO：6的CDR3；(c)包含SEQ ID NO：7的CDR1、包含SEQ ID NO：8的CDR2和包含SEQ ID NO：9的CDR3；(d)包含SEQ ID NO：10的CDR1、包含SEQ ID NO：11的CDR2和包含SEQ ID NO：12的CDR3；(e)包含SEQ ID NO：13的CDR1、包含SEQ ID NO：14的CDR2和包含SEQ ID NO：15的CDR3；(f)包含SEQ ID NO：16的CDR1、包含SEQ ID NO：17的CDR2和包含SEQ ID NO：18的CDR3；(g)包含SEQ ID NO：19的CDR1、包含SEQ ID NO：20的CDR2和包含SEQ ID NO：21的CDR3；(h)包含SEQ ID NO：22的CDR1、包含SEQ ID NO：23的CDR2和包含SEQ ID NO：24的CDR3；(I)包含SEQ ID NO：25的CDR1、包含SEQ ID NO：26的CDR2和包含SEQ ID NO：27的CDR3；(j)包含SEQ ID NO：28的CDR1、包含SEQ ID NO：29的CDR2和包含SEQ ID NO：30的CDR3；(k)包含SEQ ID NO：31的CDR1、包含SEQ ID NO：32的CDR2和包含SEQ ID NO：33的CDR3；(l)包含SEQ ID NO：34的CDR1、包含SEQ ID NO：35的CDR2和包含SEQ ID NO：36的CDR3；(m)包含SEQ ID NO：37的CDR1、包含SEQ ID NO：38的CDR2和包含SEQ ID NO：39的CDR3；(n)包含SEQ ID NO：1的CDR1、包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：40的CDR3；(o)包含SEQ ID NO：1的CDR1、包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：41的CDR3；(p)包含SEQ ID NO：1的CDR1、包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：42的CDR3；(q)包含SEQ ID NO：1的CDR1、包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：43的CDR3；(r)包含SEQ ID NO：1的CDR1、包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：44的CDR3；(s)包含SEQ ID NO：1的CDR1、包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：45的CDR3；(t)包含SEQ ID NO：1的CDR1、包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：46的CDR3；(u)包含SEQ ID NO：1的CDR1、包含SEQ ID NO：2的CDR2和包含SEQ ID NO：47的CDR3；(v)包含SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍健东，R，
申请(专利权)人：罗莎琳德，
类型：发明
国别省市：