一种敲减前B急性淋巴细胞白血病转录因子1慢病毒制备方法及应用技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，涉及一种敲减前B急性淋巴细胞白血病转录因子1慢病毒制备方法及应用。本发明专利技术敲减前B急性淋巴细胞白血病转录因子1慢病毒制备方法，是将人PBX1shRNA寡核苷酸序列克隆到GV298

【技术实现步骤摘要】
一种敲减前B急性淋巴细胞白血病转录因子1慢病毒制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种敲减前B急性淋巴细胞白血病转录因子1慢病毒制备及对癌症细胞生物学影响的应用。

技术介绍

[0002]神经母细胞瘤(NB)是最常见的颅外儿科肿瘤之一，即使采取多种方式治疗高危神经母细胞瘤患者，但5年生存率仍低于50％，且副作用明显。虽然PARP抑制剂(PARPi)用于治疗多种癌症，并可作为化学和放射曾敏剂，但PARPi在体内作为单一疗法治疗NB是无效的，并且在大多数晚期癌症患者中观察到用PARPi治疗出现耐药。因此有必要开发一种新的靶向药物治疗NB尤为重要。前B细胞白血病转录因子1(PBX1)被认为是多种癌症中的癌基因，PBX1过表达与肿瘤预后不良相关。研究发现，PBX1通过调控EGF信号通路作为侵袭性ER阳性乳腺癌的功能性标志，其扩增可在乳腺癌患者的循环游离DNA中识别，可用于识别高危患者。PBX1的表达在子宫颈癌与肿瘤增殖及生存中发挥重要作用，PBX1失活可能成为治疗子宫颈鳞癌的新方法。
[0003]申请人做过的相关研究显示，PBX1高表达预示黑色素瘤患者预后不良，下调PBX1表达显着抑制体外和体内黑色素瘤的生长和转移(参考文献：Sui Y,Liu F,Zheng S,et al.G
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quadruplexes folding mediates downregulation of PBX1expression in melanoma.Signal Transduct Target Ther.2023.8(1):12.)。
[0004]基于此，如能研发一种敲减前B急性淋巴细胞白血病转录因子1慢病毒的制备方法，并将其用于治疗NB，将是一种新的尝试，能够为肿瘤治疗提供一种新的思路和方案。
[0005]
技术介绍

[0006]神经母细胞瘤(NB)是一种产生于神经嵴细胞的周围神经系统的颅外肿瘤，它是婴儿中最常见的恶性肿瘤，也是儿童中最常见的颅外实体肿瘤。目前，对高危NB的治疗包括化疗和手术切除，然后是大剂量化疗与自体干细胞救援和放射治疗。然而，那些高危NB患者很容易复发，而且标准化疗的长期副作用很大。
[0007]前B急性淋巴细胞白血病转录因子1(PBX1)可以作为肿瘤致癌因子，调控肿瘤的发生。PBX1在高风险性神经母细胞瘤中低表达，可以作为肿瘤预后的标志物。研究发现，PBX1通过调控EGF信号通路作为侵袭性ER阳性乳腺癌的功能性标志，其扩增可在乳腺癌患者的循环游离DNA中识别，可用于识别高危患者。PBX1的表达在子宫颈癌与肿瘤增殖及生存中发挥重要作用，PBX1失活可能成为治疗子宫颈鳞癌的新方法。
[0008]基于此，如能研发一种敲减前B急性淋巴细胞白血病转录因子1慢病毒的制备方法，并将其用于治疗NB，这是一种新的尝试，能够为肿瘤治疗提供一种新的思路和方案。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的就在于提供一种敲减前B细胞白血病转录因子1的慢病毒制备方法，
还提供一种所制慢病毒在肿瘤预防和治疗的药物筛选以及SH
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SY5Y细胞损伤修复机制方面的应用，以解决将目的质粒及包装质粒转染致293T细胞以产生慢病毒，并应用对于癌症细胞生物学影响的问题。
[0010]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0011]一种敲减前B急性淋巴细胞白血病转录因子1慢病毒制备方法，包括以下步骤：
[0012]A、将慢病毒表达载体相关菌液进行质粒提取；
[0013]B、将目的质粒和包装质粒共转染到293T细胞以产生慢病毒；
[0014]C、利用慢病毒感染细胞系，活细胞工作站及Western Blot进行验证。
[0015]进一步地，具体为：通过慢病毒包装的方法以产生shPBX1病毒，并用shPBX1病毒感染SH
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SY5Y细胞以构建稳定表达shPBX1的shPBX1
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SH
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SY5Y细胞系。
[0016]进一步地，步骤A，所述质粒为Vector shRNA pLVX
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IRES
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mCherry、shPBX1pLVX
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IRES
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mCherry质粒及包装质粒ps.PAX2、pMD2.G中的一种。
[0017]进一步地，步骤A，所述质粒相关酶切位点为AgeI和BamHI。
[0018]进一步地，步骤A，所述慢病毒为shPBX1慢病毒、shPBX1腺病毒或者小干扰RNA PBX1。
[0019]进一步地，步骤C，所述细胞为神经母细胞瘤细胞、小胶质瘤细胞、肝癌细胞及宫颈癌细胞。
[0020]一种敲减前B急性淋巴细胞白血病转录因子1慢病毒制备方法所制慢病毒的应用，在对SH
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SY5Y细胞生物学影响的应用。
[0021]进一步地，能够抑制SH
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SY5Y细胞增殖并促进ROS积累和凋亡，诱导SH
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SY5Y细胞DNA损伤，可用于治疗NB。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0023]本专利技术将人PBX1 shRNA寡核苷酸序列克隆到GV298
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GFP慢病毒载体中，通过将目的质粒及包装质粒转染致293T细胞以产生慢病毒，再利用慢病毒感染细胞的特性以获得稳定表达的shPBX1细胞系；Western Blot结果显示本专利技术构建的细胞系敲低效率高；PBX1敲低可诱导SH
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SY5Y细胞发生ROS、DNA损伤和凋亡，可用于肿瘤预防和治疗的药物筛选以及SH
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SY5Y细胞损伤修复机制研究。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0025]图1为活细胞工作站观察shPBX1和Vector慢病毒感染SH
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SY5Y细胞48小时后的明场及荧光图片；
[0026]图2为Western Blot，用PBX1抗体鉴定shPBX1的结果；
[0027]图3为通过细胞计数验证shPBX1细胞增殖结果；
[0028]图4为通过流式细胞术检测shPBX1后SH
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SY5Y细胞内ROS水平；
[0029]图5为通过流式细胞术检测shPBX1后SH
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SY5Y细胞发生凋亡情况；
[0030]图6为Western Blot，用Caspase依赖的凋亡抗体(Cyt C和Caspase
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3)、非Caspase依赖的凋亡抗体(PARP1和AIF)以及DNA损伤修复相关抗体(PAR、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种敲减前B急性淋巴细胞白血病转录因子1慢病毒制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、将慢病毒表达载体相关菌液进行质粒提取；B、将目的质粒和包装质粒共转染到293T细胞以产生慢病毒；C、利用慢病毒感染细胞系，活细胞工作站及Western Blot进行验证。2.根据权利要求1所述的一种敲减前B急性淋巴细胞白血病转录因子1慢病毒制备方法，其特征在于：通过慢病毒包装的方法以产生shPBX1病毒，并用shPBX1病毒感染SH
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SY5Y细胞以构建稳定表达shPBX1的shPBX1
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SH
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SY5Y细胞系。3.根据权利要求1所述的一种敲减前B急性淋巴细胞白血病转录因子1慢病毒制备方法，其特征在于：步骤A，所述质粒为Vector shRNA pLVX
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IRES
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mCherry、shPBX1 pLVX
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IRES
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mCherry质粒及包装质粒ps.PAX2、pMD...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晋宇，左魁阳，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：