一种超大分子的病毒过滤方法技术

本发明专利技术公开了一种超大分子的病毒过滤方法，属于生物制品安全性领域。本发明专利技术利用氯化钠对除病毒过滤的缓冲体系进行改进，采用20nm的除病毒滤器载量和病毒截留能力均有明显提升，除病毒滤器质量载量可提高至1500g/m2，对于鼠细小病毒的截留效果可提高至≥5.96

【技术实现步骤摘要】
一种超大分子的病毒过滤方法


[0001]本专利技术涉及一种超大分子的病毒过滤方法，属于生物制品安全性领域。

技术介绍

[0002]由于生物制品通常是直接注射给药，产品若遭受病毒污染，对患者可能造成重大伤害。在人类历史上，疫苗和血液制品等都曾出现过病毒污染的案例，因此生物制品中的病毒防护和去除一直以来是各监管部门重点关注的内容，根据《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价的技术审评一般原则》的要求，生产工艺中必须包含病毒去除/灭活的有效工艺步骤，目前国内对静注人免疫球蛋白中的病毒去除或灭活主要采用低pH孵放、纳米膜过滤、巴氏灭活和有机溶剂(S/D)法等，其中低pH孵放、巴氏消毒和S/D法对脂包膜病毒效果较好，而对非脂包膜病毒效果有限，且病毒灭活过程中对蛋白存在一定的破坏，影响产品的收率。纳米膜过滤技术作为病毒清除步骤，由于其操作简单温和，机制明确，易于验证等优点，对脂包膜、非脂包膜以及细小病毒都有良好的去除效果，且易保持天然活性，已被广泛用于纯化工艺中的病毒安全保障。当前应用较为广泛的是截留孔径为20nm的除病毒过滤器，以尺寸排阻的机制实现病毒清除，其作用机制是基于病毒大于滤膜孔径，产品穿过滤膜而病毒被截留，不仅可以用来有效清除鼠细小病毒(Minute virus ofmice，MVM)，同时也能够极其有效地去除直径80～100nm的小鼠白血病病毒以及其余种类的病毒颗粒。
[0003]对于超大分子产品，比如IgM(粒径35nm左右)，通常以五聚体的形式存在，分子量可高达950kDa及以上，因此使用传统的除病毒过滤工艺在20nm孔径的除病毒过滤器上通量会迅速衰减，从而阻断过滤，无法实现对于鼠细小病毒等的有效截留，为IgM类生物制品带来了重大的安全隐患。实现超大分子产品的纳米膜过滤除病毒对生物制品的下游纯化具有极大意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种显著改善超大分子产品除病毒过滤通量迅速衰减的特殊缓冲体系。即在超大分子产品所处的缓冲液环境中，加入高纯氯化钠直至缓冲液环境达到高盐浓度(1.5mol/L氯化钠)，后在20nm孔径的除病毒过滤器上进行过滤，以实现高过滤通量、高过滤载量、高除病毒效果的超大分子产品除病毒过滤。
[0005]本专利技术提供一种超大分子的病毒过滤方法，向待过滤的体系中加入终浓度为1.45mol/L～1.55mol/L的氯化钠，然后进行纳米膜过滤，所述纳米膜过滤的孔径为18～22nm，所述超大分子产品为含免疫球蛋白M的药品。
[0006]在本专利技术的一种实施方式中，所述病毒过滤方法包括以下步骤：
[0007](1)向待过滤溶液中加入氯化钠，并且调节pH到6.9～7.0，形成除病毒过滤上样液；
[0008](2)在恒压条件下将步骤(1)所得除病毒过滤上样液串联通过预过滤器和除病毒
滤器；
[0009](3)收集过滤后的溶液；
[0010](4)用除病毒过滤平衡缓冲液冲洗除病毒过滤膜并收集，得到润洗液；
[0011](5)合并步骤(3)和步骤(4)所得溶液。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)所述除病毒过滤上样液中免疫球蛋白M的浓度为1.19g/L～1.25g/L g/L。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)所述恒压条件为30psi～43.5psi，所述预过滤器为Viresolve Prefilter系列或CobetterPDT系列，所述除病毒滤器为Planova
TM BioEX系列或CobetterVF系列，所述除病毒滤器的孔径为20nm。
[0014]本专利技术还提供一种提高免疫球蛋白M纳米膜通透性的方法，将免疫球蛋白M与终浓度为1.45mol/L～1.55mol/L的氯化钠混合。
[0015]本专利技术还提供一种提高超大分子产品病毒过滤载量的试剂盒，所述试剂盒包括预过滤器、除病毒滤器和缓冲体系；所述缓冲体系中含有终浓度为1.45mol/L～1.55mol/L的氯化钠。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述预过滤器为Viresolve Prefilter系列或CobetterPDT系列；所述除病毒滤器为Planova
TM BioEX系列或CobetterVF系列，所述除病毒滤器的孔径为20nm。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述超大分子产品为含免疫球蛋白M的药品。
[0018]本专利技术还提供所述病毒过滤方法，或提高免疫球蛋白M纳米膜通透性的方法，或所述试剂盒在超大分子产品除病毒或制备超大分子产品中的应用，所述超大分子产品为含免疫球蛋白M的药品。
[0019]有益效果
[0020]IgM在传统的除病毒过滤缓冲体系中，采用20nm的除病毒滤器通量衰减迅速，因此载量仅为50g/m2，而采用孔径更大的35nm的除病毒滤器过滤后载量虽可提升至500g/m2，但对于鼠细小病毒的截留效果仅为0.22
±
0.50log
10
TCID
50
；改进后的缓冲体系，采用20nm的除病毒滤器载量和病毒截留能力均有明显提升，除病毒滤器质量载量可提高至1500g/m2，对于鼠细小病毒的截留效果可提高至≥5.96
±
0.25Log
10
TCID
50
。
附图说明
[0021]图1：不同缓冲体系过滤20nm和35nm除病毒滤器的对比图
具体实施方式
[0022]本专利技术涉及的材料如下：
[0023]模型病毒：MVM，来自ATCC，产品编号VR
‑
1346，模型病毒母液从超低温冰箱中取出37.0℃
±
1.0℃水浴解冻，并用0.45μm过滤器过滤。
[0024]技术术语：
[0025]待过滤溶液：含IgM蛋白(纯度98％以上)的溶液。
[0026]除病毒过滤上样液：含有一定浓度的模型病毒的待过滤溶液。
[0027]除病毒过滤平衡缓冲液：20mmol/LTris
‑
HCl,1.45～1.55mol/LNaCl,pH 6.5。
[0028]本专利技术涉及的检测方法如下：
[0029]病毒检测方法：
[0030]指示细胞培养：将指示细胞A9(ATCC CCL
‑
1.4)于DMEM培养基中培养，以3*103个细胞/孔(100uL培养基/孔)的密度接种在96孔板中，每个条件设4个平行。然后放入温度参数设置为37.0℃、二氧化碳浓度参数设置为5.0％的培养箱培养24h。
[0031]细胞受病毒感染的定义：如果样品对应的指示细胞的生长状态发生病变情况，则判定细胞受病毒感染。
[0032]病毒检测：通过TCID
50
测定法滴定病毒的滴度。将测试样品用无血清培养基进行系列稀释，然后加样到指示细胞A9(ATCC CCL
‑
1.4)中，孵育一定时间后，在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种超大分子的病毒过滤方法，其特征在于，向待过滤的体系中加入终浓度为1.45mol/L～1.55mol/L的氯化钠，然后进行纳米膜过滤，所述纳米膜过滤的孔径为18～22nm，所述超大分子产品为含免疫球蛋白M的药品。2.如权利要求1所述病毒过滤方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向待过滤溶液中加入氯化钠，并且调节pH到6.9～7.0，形成除病毒过滤上样液；(2)在恒压条件下将步骤(1)所得除病毒过滤上样液依次通过串联连接的预过滤器和除病毒滤器；(3)收集过滤后的溶液；(4)用除病毒过滤平衡缓冲液冲洗除病毒过滤膜并收集，得到润洗液；(5)合并步骤(3)和步骤(4)所得溶液。3.如权利要求2所述病毒过滤方法，其特征在于，步骤(1)所述除病毒过滤上样液中免疫球蛋白M的浓度为1.19g/L～1.25g/L。4.如权利要求3所述病毒过滤方法，其特征在于，步骤(2)所述恒压条件为30psi～43.5psi，所述预过滤器为Viresolve Prefilter系列或CobetterPDT系列，所述除病毒滤器为Planova
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【专利技术属性】
技术研发人员：李智，诸葛鑫，李敏，陈紫娟，张梦，徐书凤，
申请(专利权)人：智享生物苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：