本发明专利技术公布了特异性结合猪圆环病毒3型抗原表位的单克隆抗体及其应用，通过预测PCV3Cap蛋白的B细胞表位，分别构建针对这两个表位的原核表达载体，并诱导蛋白表达，用表达的蛋白作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体，且这两株抗体之间没有交叉反应。利用PCV3Cap蛋白的两个表位抗体建立双抗体夹心ELISA方法，具有同时识别PCV3病原、特异性强、与其他病毒没有交叉反应、成本低廉、操作简便、时间周期短、特异性强、通量大的优点。建立的双抗体夹心的检测方法还可以用来准确定量PCV3亚单位疫苗中的抗原含量，为当前PCV3的诊断和流行病学调查提供技术手段，为开发PCV3病原的相关检测ELISA试剂盒的研发工作提供技术支持，为相关疾病的诊断提供新数据。疾病的诊断提供新数据。疾病的诊断提供新数据。
【技术实现步骤摘要】
特异性结合猪圆环病毒3型抗原表位的单克隆抗体及其应用
[0001]本专利技术属于兽医生物
；涉及特异性结合猪圆环病毒3型抗原表位的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
[0002]猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)为圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员，猪圆环病毒病是由猪圆环病毒引起的，感染猪后发生一系列传染性疾病的总称。截至目前为止发现了四个型，即PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。其中，PCV1至今未发现其对猪具有致病性；PCV2具有较强的致病性，可引起宿主机体的免疫抑制，造成免疫功能低下；PCV4是2019年在我国湖南省发现一株新的圆环病毒，其流行情况和致病性尚不确定；PCV3作为一种新发病毒，2016年在美国首次报道，在世界范围广为流行，目前在中国诸多省份均被检测到，表明该型病毒在中国出现流行趋势。根据相关研究发现，PCV3具有比PCV2更高的致病性，并且PCV3感染猪只在临床上的表征与PCV2相似，难以准确诊断此疾病。因此建立一种准确检测PCV3的检测方法，对PCV3的检测和防控具有重要的意义。
[0003]PCV3病毒粒子形态为二十面体对称结构，且无囊膜，基因组为单股DNA，其中ORF2编码病毒的主要结构蛋白，即核衣壳蛋白Cap，由214个氨基酸组成。PCV3 Cap蛋白与PCV1和PCV2的Cap蛋白的氨基酸同源性比较低，且不具有交叉免疫保护的特性，可以作为区分圆环病毒感染和疫苗研究的靶蛋白。目前，关于PCV3检测方法的研究主要集中在病原学方法和血清学方法，病原学检测方法主要为PCR技术，包括常规PCR、双重PCR、套式PCR、荧光定量PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)、宏基因组测序；血清学检测方法主要为间接免疫荧光(IFA)、免疫组化(IHC)、间接酶联免疫吸附实验(间接ELISA)等。其中PCR、间接免疫荧光(IFA)、免疫组化(IHC)等检测常需要特殊的仪器,且操作费时，处理量小，无法做到日常的感染检测；间接ELISA方法无法对待检抗原进行准确定量，交互反应发生的几率较高，酶标二抗只能识别IgG,灵敏度低，特异性较差。
[0004]鉴于PCV3在我国多个省区较高的流行率和感染率，以及给生猪产业等相关领域带来的巨大经济损失，由于目前没有PCV3疫苗，PCV3的流行病学研究备受重视，尤其是分子流行病学调查，在之前的研究中，病原学等检测方法处理样本量较少、成本高、时间周期长、灵敏度低、特异性不高且受场地和特殊仪器等限制，因此急需建立一种灵敏度高、特异性强、时间周期短，样本检测量大的方法来检测PCV3的感染情况。
技术实现思路
[0005]本专利技术使用生物信息学软件预测PCV3 Cap蛋白B细胞抗原表位，根据预测结果选定靶序列，构建并表达针对PCV3不同表位的两种原核蛋白，制备获得针对不同表位的两种单克隆抗体，利用这两个单克隆抗体建立检测猪PCV3病原的双抗体夹心ELISA方法，操作简单、快速、高通量处理样本、具有良好特异性的同时又能用于研制亚单位疫苗中Cap蛋白的定量和猪场PCV3病原的检测，为调查PCV3在中国流行及感染情况提供技术支持，同时也为
开发PCV3病毒的相关检测试剂盒的研发工作奠定了基础。
[0006]具体的，本专利技术构建并表达了PCV3 1
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106aa、107
‑
214aa序列的原核表达载体，将表达和纯化的两个蛋白作为免疫原加入佐剂，乳化后免疫Balb/c小鼠，并分离免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合。利用单克隆抗体制备技术，通过亚克隆、免疫荧光、间接ELISA、WB等手段筛选得到两株分泌针对Cap蛋白不同表位的杂交瘤细胞株，扩大培养，制备单克隆抗体并建立双抗体夹心ELISA检测方法。
[0007]本专利技术涉及特异性结合猪圆环病毒3型抗原表位的鼠单克隆抗体抗Cap
107
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214
的可变区序列，其中，所述单克隆抗体Cap
107
‑
214
的轻链可变区为SEQ ID No.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体的重链可变区为SEQ ID No.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
[0008]本专利技术涉及特异性结合猪圆环病毒3型抗原表位的抗体，其中，所述抗体的轻链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体重链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述抗体为单克隆抗体抗Cap
107
‑
214
，所述抗体保持特异性结合PCV3 ORF2基因中表达的第107～214位氨基酸序列的能力。
[0009]所述单克隆抗体抗Cap
107
‑
2146
轻链可变区为SEQ ID No.1或其简并序列编码，重链可变区为SEQ ID No.2或其简并序列编码。
[0010]所述单克隆抗体抗Cap
107
‑
214
效价不低于1：106。
[0011]本专利技术涉及特异性结合猪圆环病毒3型抗原表位的鼠单克隆抗体抗Cap1‑
106
的可变区序列，其中，所述单克隆抗体Cap1‑
106
的轻链可变区为SEQ ID No.3所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体的重链可变区为SEQ ID No.4所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
[0012]本专利技术涉及特异性结合猪圆环病毒3型抗原表位的抗体，其中，所述抗体的轻链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体的重链可变区为SEQ.ID No.4所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述抗体为单克隆抗体抗Cap1‑
106
，所述抗体保持特异性结合PCV3 ORF2基因中表达的第1～106位氨基酸序列的能力。
[0013]所述单克隆抗体抗Cap1‑
106
轻链可变区为SEQ ID No.3或其简并序列编码，重链可变区为SEQ ID No.4或其简并序列编码。
[0014]所述单克隆抗体抗Cap1‑
106
效价不低于1：107本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.特异性结合猪圆环病毒3型抗原表位的鼠单克隆抗体抗Cap
107
‑
214
的可变区序列，其中，所述单克隆抗体Cap
107
‑
214
的轻链可变区为SEQ ID No.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体的重链可变区为SEQ ID No.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。2.特异性结合猪圆环病毒3型抗原表位的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体重链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述抗体为单克隆抗体抗Cap
107
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214
，所述抗体保持特异性结合PCV3 ORF2基因中表达的第107～214位氨基酸序列的能力。3.特异性结合猪圆环病毒3型抗原表位的鼠单克隆抗体抗Cap1‑
106
的可变区序列，其中，所述单克隆抗体Cap1‑
106
的轻链可变区为SEQ ID No.3所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体的重链可变区为SEQ ID No.4所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。4.特异性结合猪圆环病毒3型抗原表位的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体的...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙婉莹，徐高原，邵伟，周明光，王斌，罗修鑫，张翠丽，聂玉，陈章表，金建云，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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