一种多聚磷酸激酶突变体及其在制备胞二磷胆碱中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多聚磷酸激酶突变体及其在制备胞二磷胆碱中的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术筛选获得了一种野生型多聚磷酸激酶，可在大肠杆菌中高效表达，通过对其定点突变改造，又获得了活性显著提高的多聚磷酸激酶突变体，能够实现CTP的高效率再生并降低生物催化成本。该突变体酶的最适pH为7.5，最适酶活温度为70℃，对70

【技术实现步骤摘要】
一种多聚磷酸激酶突变体及其在制备胞二磷胆碱中的应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学和酶工程领域，具体涉及一种多聚磷酸激酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]多聚磷酸激酶(Polyphosphate kinase，PPK)可以催化核苷三磷酸NTP（ATP/CTP/GTP/UTP）转化为多聚磷酸（PolyP），且该反应为可逆反应，因此它也可以以PolyP作为磷酸供体催化NDP/NMP转化为NDP/NTP，以实现能量的循环(Green Chem,2021,23,828
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837)。根据PPK的结构，PPK主要被分为三类：以PolyP和NDP为底物催化合成NTP的PPK1和PPK2，以PolyP和NMP为底物催化合成NTP的PPK3。
[0003]目前关于PPK的研究报道大部分集中以聚磷酸为磷酸供体将AMP转化为ADP或者ATP，而以聚磷酸为磷酸供体将CMP转化为CDP或CTP的研究较少。因此，开发一类新型多聚磷酸激酶，能够利用廉价PolyP原料直接将CMP转化为CDP或CTP具有广泛的应用前景。
[0004]胞二磷胆碱（又称为CDP
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胆碱或CDPC），分子量488.33，分子式C14H26N4O11P2，作为体内磷脂合成的中间体能促进卵磷脂的生物合成，改善脑循环和代谢，恢复神经组织功能，其作为脑代谢激活剂，具有改善记忆、增加智力、修复脑损伤等作用,在临床上广泛用于急性脑外伤、脑手术后思维障碍、治疗帕金森综合征等，是一种重要的细胞代谢改善药物。
[0005]现有胞二磷胆碱的合成方法主要分为化学合成法，微生物转化法和酶催化合成法。其中，化学合成法存在转化率低、环境污染严重等问题，因此不适合用作大规模生产。微生物转化法主要是利用废弃啤酒酵母为生物催化剂，以胞苷酸CMP、葡萄糖和磷酸盐为原料，制造胞二磷胆碱，转化率60
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70%，但是存在酵母收集困难，废弃酵母催化活性波动较大，转化率不稳定，转化率低，产物纯化困难等缺陷。酶催化合成法早期是以胞苷三磷酸CTP和磷酸胆碱为原料在磷酰胆碱胞苷转移酶的催化下合成胞二磷胆碱，但是CTP成本较高不利于大规模应用。
[0006]近年来，生物学工作者针对酶催化合成法成本高的缺点，开发了以胞苷和磷酸胆碱为原料的酶催化合成法。
[0007]中国专利CN112481233A中公开的制备方法，以胞苷和氯化胆碱为底物，在胞苷激酶、胞苷酸激酶、聚磷酸激酶、二磷酸核苷激酶、胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶这六种酶的催化下合成胞二磷胆碱，其工艺路线如下：
[0008]此方法的缺陷在于，CMP和磷酸胆碱目前价格都比较便宜，为了制备这两种中间产物，需要额外增加两步反应，用酶种类过多，反应控制复杂，产物浓度较低，仅有27mM，产物中残留ATP和ADP及可能的ATP降解物，纯化难度较大，难以实现规模化生产。

技术实现思路

[0009]专利技术目的：针对现有技术中所存在的过程复杂、添加酶种类多、不利于反应过程控制的缺陷，本专利技术提供了一种对CMP有高催化活性的多聚磷酸激酶cPPK的突变体，它能够以PolyP为磷酸供体催化CMP生成CTP，无需添加ATP作为磷酸根循环载体，并将该酶与磷酸胆碱胞苷转移酶liC配合，以CMP和磷酸胆碱为底物进行双酶法合成胞二磷胆碱，其工艺路线如下：
[0010]技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术利用基因工程技术对来自于Candidatus Poribacteria bacterium菌的多聚磷酸激酶，进行改造和筛选，构建以六偏磷酸钠为底物的高性能多聚磷酸激酶突变体，从而有利于实现以PolyP为底物的CTP再生系统的工业化应用。
[0011]为此，本专利技术通过定点突变技术对Candidatus Poribacteria bacterium来源的多聚磷酸激酶进行改造，获得以六偏磷酸钠作为底物的高酶活的多聚磷酸激酶突变体，以便高效地催化六偏磷酸钠上的高能磷酸键转移至CMP上，产生CTP。具体而言，本专利技术包括如下技术方案。
[0012]一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1:
MSQPIKLPLGKKIKLDDFDPDYMAGHDEGRRKMRKKLTEITNEIIELQELLYAESKHALLIVLQAMDAGGKDGTIKHVMEAVNPQGCDVVSFKVPSDEEAAHDFLWRAHKAAPRKGKIVIFNRSHYEDVLVTRVHNFVPKSVWKKRYDQINSFEKILSQSQISILKFFLYISKKEQKKRFKNRLENPDKHWKFSPADLRERAYWDSYMEAFEDVFNNCNTKWAPWHIIPSNDKRCRDLIIAETIAKTLKNLNMKYPEPSVDIASINVNDII (SEQ ID NO:1)。
[0013]其为野生型多聚磷酸激酶(cPPK) 的氨基酸序列SEQ ID NO:3第80位的G替换为E、第152位的E替换为S、第182位的D替换为N的突变体。
[0014]本专利技术还提供了编码上述多聚磷酸激酶突变体基因。
[0015]优选地，编码上述多聚磷酸激酶突变体SEQ ID NO:2 的基因可以是下述核苷酸序列:ATGTCACAACCCATAAAACTACCATTAGGAAAGAAGATCAAGTTAGATGATTTCGACCCGGATTATATGGCGGGCCATGATGAGGGCCGTCGTAAGATGCGTAAGAAGTTGACCGAAATCACCAATGAGATCATCGAACTCCAAGAGTTGTTGTACGCCGAGAGCAAGCACGCGCTGCTGATCGTCCTGCAAGCTATGGATGCAGGTGGTAAAGACGGCACTATTAAACACGTGATGGAAGCGGTGAACCCGCAGGGTTGTGATGTCGTGAGCTTTAAAGTTCCGTCCGACGAGGAAGCTGCCCACGACTTCCTGTGGCGTGCGCACAAAGCAGCTCCTCGCAAGGGCAAAATTGTGATTTTCAATCGTAGCCATTATGAAGACGTATTGGTTACCCGTGTTCATAATTTTGTTCCGAAATCTGTTTGGAAAAAGAGATACGACCAGATCAACTCGTTTGAGAAAATCCTGAGCCAAAGCCAGATTAGCATTCTTAAGTTCTTCCTGTACATTTCGAAGAAGGAGCAGAAAAAGCGCTTTAAGAACCGCCTGGAAAACCCAGATAAACATTGGAAATTCTCCCCGGCAGACCTGCGTGAACGTGCGTATTGGGATTCCTATATGGAAGCGTTCGAGGACGTGTTTAACAACTGCAACACCAAATGGGCACCGTGGCACATTATCCCGAGTAATGACAAGCGCTGCCGTGATCTGATTATCGCGGAAACCATCGCCAAAACGCTGAAAAACCTGAATAT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多聚磷酸激酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。2.编码如权利要求1所述多聚磷酸激酶突变体的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:2。4.包含如权利要求3所述基因的表达载体。5.转化了如权利要求4所述表达载体的微生物。6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。7.如权利要求l所述多聚磷酸激酶突变体或者如权利要求6所述微生物在催化制备胞二磷胆碱中的用途。8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，以胞苷酸CMP、聚磷酸PolyP和磷酸胆碱为底物，使用磷酸胆碱胞苷转移酶作为生...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈圣，章志林，
申请(专利权)人：苏州酶泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：