一种干细胞外泌体制备方法、该方法制备的外泌体及在护肤方面的应用技术

本发明专利技术公开了一种干细胞外泌体制备方法、该方法制备的外泌体及在护肤方面的应用。制备方法中包括用含有六胜肽的完全培养基对人脐带间充质干细胞培养。本发明专利技术制备方法获得的人脐带间充质干细胞外泌体比普通人脐带间充质干细胞外泌体能更有效地促进真皮成纤维细胞产生Ⅰ型胶原蛋白。人体皮肤中的胶原主要是Ⅰ型，Ⅰ型胶原约占皮肤胶原干重的70％

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞外泌体制备方法、该方法制备的外泌体及在护肤方面的应用


[0001]本专利技术属于生物领域，涉及干细胞外泌体，具体涉及一种干细胞外泌体制备方法、该方法制备的外泌体及在护肤方面的应用。

技术介绍

[0002]外泌体是细胞通过特殊的内吞外排机制主动向胞外分泌的一种直径为30～120nm的微型囊泡，几乎所有的活细胞都可以分泌外泌体。此外，外泌体还存在于唾液、血浆、尿液等多种类型的体液中。外泌体主要由脂质、蛋白质和核酸构成，脂质构成了外泌体的膜结构，为外泌体提供了结构稳定性并包裹着蛋白和核酸等活性物质。正常细胞来源的外泌体能够有效清除细胞代谢废物并介导细胞间信息转导，但某些特殊细胞分泌的外泌体，由于携带分泌细胞的特异性活性物质，因此具有特殊的生物学功能。
[0003]间质干细胞是一种来源于中胚层并广泛分布于全身各组织中的干细胞，具有高度的多向分化能力和自我更新能力。许多类型的间充质干细胞来源的外泌体在组织损伤修复、免疫调节、美容护肤等方面发挥着重要作用。
[0004]因为间充质干细胞外泌体资源宝贵，所以提高间充质干细胞外泌体的生物活性成为间充质干细胞外泌体研究的热门方向。

技术实现思路

[0005]本专利技术是为了克服现有技术的缺陷和不足，提供一种干细胞外泌体制备方法、该方法制备的外泌体及在护肤方面的应用，该外泌体生物活性更强。
[0006]本专利技术上述目的通过如下技术方案实现：
[0007]一种干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：
[0008]取人脐带间充质干细胞，先用完全培养基于37℃、5％CO2饱和湿度条件下适应培养一段时间，然后更换为含有六胜肽的完全培养基继续培养一段时间，收集细胞，用PBS洗涤，重新用完全培养基于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，收集培养上清液，采用常规的超速离心法提取脐带间充质干细胞外泌体。
[0009]进一步地，超速离心法具体步骤如下：
[0010]步骤S1，300
×
g离心10min，弃去沉淀，收集上清液；
[0011]步骤S2，2000
×
g离心10min，弃去沉淀的死细胞，收集上清液；
[0012]步骤S3，10000
×
g超速离心30min，弃去细胞碎片，收集上清液；
[0013]步骤S4，使用0.22μm的过滤器过滤上清液；
[0014]步骤S5，100000
×
g超速离心70min，弃去上清，收集沉淀；PBS重悬沉淀，再次100000
×
g超速离心70min，弃去上清，收集沉淀，即得。
[0015]进一步地，所述完全培养基为含10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM/F12培养基。
[0016]进一步地，六胜肽浓度为35μM。
[0017]一种任一所述制备方法制备的干细胞外泌体。
[0018]上述干细胞外泌体在提高皮肤细胞产生胶原蛋白的能力中的应用。
[0019]上述干细胞外泌体在制备促进皮肤胶原蛋白产生的护肤品中的应用。
[0020]技术效果：
[0021]本专利技术提供了一种人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，该制备方法获得的人脐带间充质干细胞外泌体比普通人脐带间充质干细胞外泌体能更有效地促进真皮成纤维细胞产生Ⅰ型胶原蛋白。人体皮肤中的胶原主要是Ⅰ型，Ⅰ型胶原约占皮肤胶原干重的70％
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80％，是皮肤承受拉力及维持皮肤丰满的重要基础。皮肤衰老或受损后Ⅰ型胶原含量会显著降低。因此，本专利技术制备方法获得的干细胞外泌体可以用于制备促进皮肤胶原蛋白产生的护肤品。
附图说明
[0022]图1为干细胞多向分化结果；
[0023]图2为透射电镜观察的干细胞外泌体的形态；
[0024]图3为Ⅰ型胶原相对表达量。
具体实施方式
[0025]一、实验材料
[0026]胎牛血清、DMEM/F12培养基购自Gibco公司。青链霉素购自Sigma公司。
[0027]无外泌体的胎牛血清购自美国SBI。
[0028]人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基、人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基和人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
[0029]六胜肽(CAS号：616204
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22
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9)购自吉尔生化，纯度98％。
[0030]小鼠真皮成纤维细胞、小鼠真皮成纤维细胞完全培养基、qRT
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PCR试剂盒购自碧云天。
[0031]qRT
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PCR引物购自广州锐博。
[0032]二、实验方法
[0033]1、脐带间充质干细胞分离培养和多向分化能力鉴定
[0034]取足月顺产的新生儿脐带，剥离动脉和静脉血管，剪成约1mm3大小的组织块。将组织块铺在25cm2培养瓶中，加入含10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM/F12培养基(完全培养基)，置37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养，细胞爬出融合约60％时，弃去组织块，待细胞融合约90％时，胰蛋白酶消化，待镜下观察细胞收缩并悬浮时加入DMEM/F12培养基终止消化，收集细胞悬液，1000
×
g离心8min，收获沉淀，加入完全培养基重悬。将原代细胞1:1传代至新的培养瓶中，即为第1代脐带间充质干细胞，每3d换液1次，当细胞融合约90％时胰酶消化，按1:2传代，即为第2代、第3代。取第3代脐带间充质干细胞，分别用人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基、人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基和人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化培养基诱导分化，鉴定其多向分化能力。
[0035]2、外泌体制备和形态观察
[0036]取第3代脐带间充质干细胞，消化，用完全培养基重悬后接种于25cm2培养瓶中，分
为对照组和六胜肽组，置37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养24h后，六胜肽组更换为含有35μM六胜肽的完全培养基继续培养，对照组更换新鲜的完全培养基继续培养。继续培养72h后，收集细胞。用PBS洗涤3次，重新用完全培养基于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养48h，收集培养上清液，采用常规的超速离心法提取各组脐带间充质干细胞的外泌体。
[0037]超速离心法具体步骤如下：
[0038]步骤S1，300
×
g离心10min，弃去沉淀，收集上清液；
[0039]步骤S2，2000
×
g离心10min，弃去沉淀的死细胞，收集上清液；
[0040]步骤S3，10000
×
g超速离心30min，弃去细胞碎片，收集上清；
[0041]步骤S4，使用0.22μm的过滤器过滤上清；
[0042]步骤S5，100000
×
g超速离心70min，弃去上清，收集沉淀；PBS重悬沉淀，再次100000
×...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取人脐带间充质干细胞，先用完全培养基于37℃、5％CO2饱和湿度条件下适应培养一段时间，然后更换为含有六胜肽的完全培养基继续培养一段时间，收集细胞，用PBS洗涤，重新用完全培养基于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，收集培养上清液，采用常规的超速离心法提取脐带间充质干细胞外泌体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，超速离心法具体步骤如下：步骤S1，300
×
g离心10min，弃去沉淀，收集上清液；步骤S2，2000
×
g离心10min，弃去沉淀的死细胞，收集上清液；步骤S3，10000
×
g超速离心30min，弃去细胞碎...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷文中，冯锋，
申请(专利权)人：南京思睿克医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：