一种酵母细胞壁-抗菌肽A3复合制剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种酵母细胞壁

【技术实现步骤摘要】
一种酵母细胞壁
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抗菌肽A3复合制剂及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及酵母高值化利用
，具体涉及一种酵母细胞壁
‑
抗菌肽A3复合制剂及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]近年来，随着养殖业向集约化、规模化、高密度转型，饲养畜禽容易遭受多种应激影响，主要表现为免疫力降低、易发病、死亡率高，畜产品质量受影响，可明显降低养殖效益。通过饲料添加剂手段解决以上问题，成为一种常规途径。
[0003]酵母细胞壁是一种全新的天然绿色添加剂，酵母细胞壁主要包含β
‑
葡聚糖和甘露聚糖。β
‑
葡聚糖具有免疫调节功能，是非特异性免疫刺激多糖，能与机体的免疫细胞受体特异性结合，刺激B细胞、T细胞、自然杀伤细胞产生大量巨噬细胞，进而调控机体免疫。甘露聚糖能增加动物体液免疫和细胞免疫能力，调节肠道菌群平衡，结合吸附外源性病原菌，并具有抗辐射、抗氧化、抗肿瘤等活性功能。
[0004]由于酵母细胞的营养物质都被厚厚的细胞壁所包围，为充分利用酵母细胞内丰富的营养资源，研究高效破壁手段显得尤为重要。酵母破壁就是对酵母细胞壁进行破碎，释放出里面的营养物质。常见的酵母破壁方法有酶法、超声波法、高压均质法以及自溶法等，但现有的酵母破壁方法仍存在破壁时间长、破壁率低、酵母多糖溶出率低等问题。
[0005]抗菌肽作为大多数生物对入侵病原体的自然防御系统的重要组成部分，其具有独特的抗菌作用机制，迅速杀菌且不易引发细菌的耐药性。抗菌肽主要通过影响细胞质膜来发挥作用，因此细菌必须要改变它们膜的组成和结构来对抗菌肽产生抗药性，但这对菌体本身也会造成严重的伤害。细菌细胞膜外层富含阴离子磷脂，哺乳动物细胞膜的两性离子脂质比较丰富，这正是抗菌肽可以抗菌而对哺乳类细胞不造成损坏的主要原因。所以抗菌肽是一类极具发展潜力的生物药物。申请人在前期研究中筛选到一株产抗菌肽的多粘芽孢杆菌(CN 110484467B)，其能够自然高产小分子量(不大于5KDa)的抗菌肽，其中，分子量不大于5KDa的多肽占所述多粘芽孢杆菌蛋白上清液体积的65％以上，5KDa
‑
3KDa的多肽占量接近20％，超滤浓缩后得到的5KDa
‑
3KDa的多肽产量(蛋白浓度)高达2.73mg/mL，且其多肽纯化倍数达2.12，活性回收率达19.65％。但是，所产生的抗菌肽经胃蛋白酶作用后抑菌活性降低20％，胰蛋白酶作用后抑菌活性降低18％，因此，其口服应用效果仍有待进一步完善。
[0006]对于酵母细胞壁和抗菌肽的组合使用，专利CN 104782909A公开了一种饲料用抗菌肽脱霉剂，其采用构建酵母工程菌进行发酵生产，发酵培养过程中大量表达抗菌肽，在最终的发酵培养产物中同时具有酵母菌的细胞体和抗菌肽的表达产物，将细胞体自溶破壁后，分离纯化收集酵母细胞壁和抗菌肽，获得脱霉剂产品。但是，该专利仍是利用酵母细胞壁的吸附性能和抗菌肽的杀菌功能，未产生协同作用；而且该专利仅是提出了一个设计构想，并未对其效果进行验证。

技术实现思路

[0007]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种酵母细胞壁
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抗菌肽A3复合制剂及其制备方法与应用。本专利技术采用自溶与酶解结合的破壁方法，制备得到酵母细胞壁；然后将制备的酵母细胞壁与保藏编号为CCTCC NO：M 2019530的多粘芽孢杆菌生产的抗菌肽A3复配，能够提高抗菌肽A3在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后的抗菌活性；并且，在提高动物机体生长性能、抗氧化能力及免疫指标等方面具有协同增效作用。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]本专利技术的第一方面，提供一种酵母细胞壁
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抗菌肽A3复合制剂，由酵母细胞壁和抗菌肽A3按质量比(8
‑
10):1复配而成；
[0010]所述酵母细胞壁由如下方法制备而成：
[0011]将保藏编号CCTCC NO：M 2015209的酿酒酵母接种于酵母液体培养基中，30℃震荡培养24h，得到酵母发酵液，固液分离，将菌体沉淀稀释得到菌液，调节菌液的pH至6.0
‑
7.0，加入木瓜蛋白酶，控制温度50
‑
60℃，处理12
‑
36h；向处理后的体系中加入轻质碳酸钙，混匀，干燥，制备得到酵母细胞壁。
[0012]其中，保藏编号为CCTCC NO：M 2015209的酿酒酵母记载在申请人的另一专利CN 105062905B中。
[0013]作为优选，将菌体沉淀用水稀释至质量浓度为25
‑
35％。本专利技术的菌体沉淀的稀释浓度是经过摸索验证的，稀释浓度过高，菌液过于粘稠，不易搅拌混匀，影响破壁率；稀释浓度过低，水分含量高，菌含量低，使得木瓜蛋白酶体积添加量高，增加破壁成本。将菌体沉淀稀释至质量浓度为25
‑
35％，能够综合平衡破壁效果和破壁成本。
[0014]作为优选，所述木瓜蛋白酶的加入量为菌液体积的0.5
‰‑2‰
。
[0015]作为优选，所述轻质碳酸钙的加入量为菌液体积的5％。通过加入轻质碳酸钙能够防止酵母细胞壁因糖含量高导致的喷雾干燥过程糊塔。
[0016]作为优选，所述酵母液体培养基的组成为：葡萄糖2wt％、酵母膏0.5wt％、蛋白胨1wt％、磷酸二氢钾0.2wt％，余量为水。
[0017]作为优选，所述抗菌肽A3由如下方法制备而成：
[0018]将保藏编号为CCTCC NO：M 2019530的多粘芽孢杆菌接种于芽孢杆菌液体培养基中，37℃静置培养20h，得到多粘芽孢杆菌发酵液；将多粘芽孢杆菌发酵液离心，收集上清液，分别选用分子截留量为5KDa、3KDa的超滤膜进行超滤，收集分子量为5KDa
‑
3KDa的组分，冷冻干燥，得到抗菌肽A3。
[0019]更优选的，所述芽孢杆菌液体培养基的组成为：玉米浆0.5wt％、蛋白胨5wt％、葡萄糖3wt％、氯化钙0.25wt％，余量为水。
[0020]其中，保藏编号为CCTCC NO：M 2019530的多粘芽孢杆菌记载在申请人的另一专利CN 110484467B中。
[0021]作为优选，所述酵母细胞壁
‑
抗菌肽A3复合制剂，是由酵母细胞壁和抗菌肽A3按质量比9:1复配而成。
[0022]本专利技术的第二方面，提供上述酵母细胞壁
‑
抗菌肽A3复合制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0023]将上述方法制备的酵母细胞壁和抗菌肽A3按质量比混合均匀，即得。
[0024]本专利技术的第三方面，提供上述酵母细胞壁
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抗菌肽A3复合制剂在如下(1)或(2)中的应用：
[0025](1)提高抗菌肽A3经胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后的活性保持率；
[0026](2)制备提高动物机体生长性能、抗氧化性能和免疫能力的产品。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酵母细胞壁
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抗菌肽A3复合制剂，其特征在于，由酵母细胞壁和抗菌肽A3按质量比(8
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10)：1复配而成；所述酵母细胞壁由如下方法制备而成：将保藏编号为CCTCC NO：M 2015209的酿酒酵母接种于酵母液体培养基中，震荡培养，得到酵母发酵液，固液分离，将菌体沉淀稀释得到菌液，调节菌液的pH至6.0
‑
7.0，加入木瓜蛋白酶，控制温度50
‑
60℃，处理12
‑
36h；向处理后的体系中加入轻质碳酸钙，混匀，干燥，制备得到酵母细胞壁。2.根据权利要求1所述的酵母细胞壁
‑
抗菌肽A3复合制剂，其特征在于，酵母细胞壁的制备方法中，将菌体沉淀用水稀释至质量浓度为25
‑
35％。3.根据权利要求1所述的酵母细胞壁
‑
抗菌肽A3复合制剂，其特征在于，酵母细胞壁的制备方法中，所述木瓜蛋白酶的加入量为菌液体积的0.5
‰‑2‰
。4.根据权利要求1所述的酵母细胞壁
‑
抗菌肽A3复合制剂，其特征在于，酵母细胞壁的制备方法中，所述轻质碳酸钙的加入量为菌液体积的5％。5.根据权利要求1所述的酵母细胞壁
‑
抗菌肽A3复合制剂，其特征在于，所述抗菌肽A3由如下方法制备而成：将保藏编号为CCTCC NO：M ...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵倩，王俊贤，王红，单宝龙，陈雷，谷巍，崔海英，张志焱，孙明杰，柳亚茹，高绪娜，徐海燕，张冠军，娄延会，白冬红，张明建，张甜甜，
申请(专利权)人：山东宝来利来生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：