一种量子点-DNA纳米探针、外泌体检测生物传感器及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种量子点

【技术实现步骤摘要】
一种量子点
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DNA纳米探针、外泌体检测生物传感器及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物医学
，具体为一种量子点
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DNA纳米探针、外泌体检测生物传感器及检测方法。

技术介绍

[0002]癌症是危害人类健康的重大疾病之一，极高的致死率和严重且繁多的并发症使得癌症严重影响了人们的生活质量。据统计，癌症是全球第二大死因，占全体死亡人数的六分之一，攻克癌症成为全世界共同的难题。研究表明，尽早地确诊能够在病情早期采取更加及时和有效的治疗措施，从而大大提高癌症的存活率，所以提出一种能适用于癌症早期的精准诊断方法显得尤为重要。
[0003]近些年来，一些新的技术也在逐渐的被应用于癌症的早筛，如液体活检技术。其中，外泌体(Exosome)作为近年来发现的一种具有巨大应用潜力的液体活检的标志物之一，是一类由细胞分泌到胞外的纳米脂质性囊泡。在具体液体活检过程中，主要是通过检测外泌体表面的特异性蛋白或内腔中的特异性核酸来实现肿瘤诊断。但由于肿瘤的异质性等因素，对一种特异性蛋白或核酸的检测可能缺乏对肿瘤诊断的精准性。因此，通过同时检测多种特异性蛋白或核酸可能会提高其诊断的准确性。此外，由于肿瘤外泌体在早期阶段浓度低，因此检测方法需要满足高的灵敏度。这就使得检测过程中需要结合一些信号放大技术，但这又会增加检测的时间和过程的复杂性，而且也很难达到即时诊断的目的，从而不能实现肿瘤的普适性筛查，阻碍其临床应用。因此，专利技术一种简单、方便、灵敏且快捷的肿瘤细胞外泌体检测方法具有重要的作用。r/>[0004]滚环扩增(RCA)是一种常用的信号放大技术，如：中国专利技术专利申请(申请公布号：CN110396536A，申请公布日：2019.11.01)公开了一种基于分支滚环扩增的外泌体荧光检测传感器，但是，该方案的检测方法需要在检测过程中引发RCA，由于RCA生成过程复杂、耗时长、且需要两种酶的参与，这就会大大延长检测时间，使其无法满足即时诊断的目的。
[0005]又例如：中国专利技术专利申请(申请公布号：CN111426833A，申请公布日：2020.07.17)公开了可视化检测肿瘤外泌体的新型纳米杂化物探针的制备方法，该方案制备的纳米杂化物探针与样品的混合分散液可放置在玻璃比色皿中，实现溶液态(液相)可视化检测外泌体；也可滴涂在柔性薄膜上，实现固态基底(固相)的可视化检测外泌体。虽然能够降低肿瘤外泌体的检测时间，实现可视化检测，但是，该方案制备的纳米杂化物探针无法同时对正常细胞外泌体进行定量分析；另外，样品中通常还含有复杂的蛋白等成分，部分蛋白可能会同样与该方案中单链DNA2适配体非特异性结合，从而造成检测结果出现误差，检测特异性性还有待提高。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种量子点
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DNA纳米探针、外泌体检测生物传感器及检测
方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]一种量子点
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DNA纳米探针，其制备步骤如下：
[0009]多种RCA产物的制备：部分的RCA产物是以普遍存在于所有种类细胞外泌体表面的至少一种共性表面蛋白的适配体序列作为模板序列，通过滚环扩增反应得到；其余的RCA产物是以仅表达于肿瘤细胞外泌体表面的至少一种特性表面蛋白的适配体序列作为模板序列，通过滚环扩增反应得到；
[0010]多种量子点
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DNA纳米探针的合成：上述多种RCA产物分别聚集并包封对应颜色的荧光量子点，生成对应种类的量子点
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DNA纳米探针。
[0011]在本专利技术中，量子点
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DNA纳米探针通过适配体序列和对应的外泌体表面蛋白进行特异性结合，荧光量子点为带正电荷的量子点，它们可以在特定激发波长下发射不同波长的荧光，通过静电相互作用，与RCA产物一起组装为量子点
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DNA纳米探针，基于检测蛋白的数目，本专利技术可以选择不同发射波长的荧光量子点和具有不同蛋白适配体序列的RCA产物分别组装成多个量子点
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DNA纳米探针，从而实现外泌体表面蛋白的多重检测。
[0012]不同模板序列得到的RCA产物上带有对应的适配体序列，能够特异性地结合于外泌体表面的对应蛋白。
[0013]正常细胞的外泌体几乎没有肿瘤相关蛋白，但正常细胞外泌体和肿瘤细胞外泌体的表面均具有共性表面蛋白，故而，共性表面蛋白(如：CD63蛋白)对应的量子点
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DNA纳米探针能够与所有外泌体的共性表面蛋白相结合；
[0014]而肿瘤细胞外泌体则同时含有共性表面蛋白和特性表面蛋白(仅与肿瘤细胞外泌体相关)，故能结合上述至少两种不同的量子点
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DNA纳米探针。
[0015]具体地，可将特定颜色(如：绿色)的荧光量子点和带有共性表面蛋白(如：CD63蛋白)适配体序列的RCA产物结合，形成对应的量子点(绿色)
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DNA纳米探针；可将特定颜色(如：红色)的荧光量子点和带有特性表面蛋白(如：CD63蛋白)适配体序列的RCA产物结合，形成对应的量子点(红色)
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DNA纳米探针。
[0016]正常细胞的外泌体仅结合量子点(绿色)
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DNA纳米探针，在紫外下呈现绿色，而肿瘤细胞外泌体则同时结合量子点(绿色)
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DNA纳米探针和量子点(红色)
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DNA纳米探针，在紫外下呈现明显的黄色，这不仅有着肉眼可见的区别，还能够通过检测荧光信号建立线性曲线进行定量分析。
[0017]作为本专利技术进一步的方案，所述滚环扩增反应的步骤如下：
[0018]制取模板序列和相应的引物序列，加入T4DNA连接酶，进行结合，然后，在聚合酶的催化下，以游离的dNTPS为原料，扩增出含有大量重复的适配体序列片段的长单链，即为RCA产物。
[0019]作为本专利技术进一步的方案，滚环扩增反应所用到的材料试剂和反应条件：
[0020]稀释制取各类模板序列和引物序列的buffer为去离子水；
[0021]各类模板序列和引物序列的终浓度均为0.2μM；
[0022]T4DNA连接酶的终浓度为10U，聚合酶的浓度为5U；
[0023]dNTPS的终浓度为1mM；
[0024]模板序列和引物序列结合连接的温度为37℃，时间为1h，扩增温度为37℃，时间为
1h。
[0025]作为本专利技术进一步的方案，所述量子点
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DNA纳米探针的制备步骤如下：
[0026]向RCA产物中加入镁离子和对应颜色的荧光量子点，避光孵育后，进行离心处理，去除上清中游离的荧光量子点，最后，用PBS缓冲液重悬，即可形成内部包封有荧光量子点的量子点
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DNA纳米探针。
[0027]作为本专利技术进一步的方案，量子点
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种量子点
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DNA纳米探针，其特征在于，其制备步骤如下：多种RCA产物的制备：部分的RCA产物是以普遍存在于所有种类细胞外泌体表面的至少一种共性表面蛋白的适配体序列作为模板序列，通过滚环扩增反应得到；其余的RCA产物是以仅表达于肿瘤细胞外泌体表面的至少一种特性表面蛋白的适配体序列作为模板序列，通过滚环扩增反应得到；多种量子点
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DNA纳米探针的合成：上述多种RCA产物分别聚集并包封对应颜色的荧光量子点，生成对应种类的量子点
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DNA纳米探针。2.根据权利要求1所述的一种量子点
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DNA纳米探针，其特征在于，所述滚环扩增反应的步骤如下：制取模板序列和相应的引物序列，加入T4DNA连接酶，进行结合，然后，在聚合酶的催化下，以游离的dNTPS为原料，扩增出含有大量重复的适配体序列片段的长单链，即为RCA产物。3.根据权利要求2所述的一种量子点
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DNA纳米探针，其特征在于，滚环扩增反应所用到的材料试剂和反应条件：稀释制取各类模板序列和引物序列的buffer为去离子水；各类模板序列和引物序列的终浓度均为0.2μM；T4DNA连接酶的终浓度为10U，聚合酶的浓度为5U；dNTPS的终浓度为1mM；模板序列和引物序列结合连接的温度为37℃，时间为1h，扩增温度为37℃，时间为1h。4.根据权利要求2所述的一种量子点
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DNA纳米探针，其特征在于，所述量子点
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DNA纳米探针的制备步骤如下：向RCA产物中加入镁离子和对应颜色的荧光量子点，避光孵育后，进行离心处理，去除上清中游离的荧光量子点，最后，用PBS缓冲液重悬，即可形成内部包封有荧光量子点的量子点
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DNA纳米探针。5.根据权利要求4所述的一种量子点
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DNA纳米探针，其特征在于，量子点
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DNA纳米探针的制备所用到的材料试剂：压缩RCA产物的镁离子浓度为0.1M；不同种类荧光量子点的终浓度均为0.2μM。6.根据权利要求1所述的一种量子点
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DNA纳米探针，其特征在于，共性表面蛋白的适配体序列采用CD63蛋白适配体序列；特性表面蛋白的适配体序列采用核仁素蛋白适配体序列和/或PD
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L1蛋白适配体序列。7.一种外泌体检测生物传感器，其特征在于，包括：修饰有适配体序列的纳米磁珠，纳米磁珠上修饰的适配体序列为共性表面蛋白的适配体序列，用于捕获目标样品中的所有外泌体；权利要求1
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6任一所述的量子点
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄琳，李超，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：