葫芦轻花叶病毒及其侵染性克隆载体、构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种葫芦轻花叶病毒及其侵染性克隆载体、构建方法和应用，所述葫芦轻花叶病毒(Cucurbit mild mosaic virus，CuMMV)的RNA1和RNA2全基因组序列如SEQ IDNo：21

【技术实现步骤摘要】
葫芦轻花叶病毒及其侵染性克隆载体、构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种含RNA1和RNA2组分的正单链RNA病毒葫芦轻花叶病毒(Cucurbit mild mosaic virus，CuMMV)及其侵染性克隆载体、构建方法和应用。

技术介绍

[0002]葫芦轻花叶病毒CuMMV是Fabavirus病毒属成员，最初被发现侵染南瓜引起叶片花叶症状；之后被发现能侵染葫芦科作物的多年生作物瓜蒌，引起叶片上花叶的症状。Fabavirus是Secoviridae科Comovirinae亚科的病毒属，目前该属已经有8个确定的病毒种。Fabaviruses在一些单子叶和许多双子叶中有广泛的宿主范围，已知它们以蚜虫为介体以非持续性的方式进行传播。
[0003]Fabaviruses是一种正单链RNA病毒，基因组由两个RNA即RNA1和RNA2组成，其中RNA1为5.8
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6.4kb，RNA2为3.1
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4.1kb；RNA1和RNA2各编码一个多聚蛋白，并被加工成有功能的蛋白质。RNA1编码与复制和表达相关的蛋白，包括蛋白酶所需的辅助因子(Co
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Pro)，推定解旋酶(Hel)，基因组
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连接蛋白(VPg)，蛋白酶(Pro)和RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)。RNA2编码运动蛋白(MP)和两种外壳蛋白(LCP和SCP)。作为Fabavirus属唯一自然条件下侵染葫芦科作物的病毒，CuMMV仅公布了全基因组序列，缺乏对该病毒生物学特性、致病性等方面的了解。
[0004]植物病毒的侵染性cDNA克隆是研究病毒蛋白功能及病毒与寄主的相互作用的有力工具。通过对植物侵染性克隆基因进行靶向修饰可用于研究植物病毒基因或序列的功能。基于病毒侵染性克隆的衍生载体，例如插入报告基因(β
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葡萄糖醛酸酶GUS、绿色荧光蛋白GFP等)，可用来跟踪植物病毒在植物中的运动。然而，在Fabavirus属中，仅有少部分物种的侵染性克隆被成功构建。
[0005]目前，未见CuMMV侵染性克隆的报道。部分病毒具有保守的表达特性，需要准确、完整的序列才能实现表达，对于一些含ployA尾序列的病毒，则需要添加适量的ployA尾实现病毒的致病性；在病毒基因组获得、重组转化及质粒培养、菌株表达等过程都会对病毒的致病性产生影响，需要基于病毒特性、精细把控各环节，从而实现有活性的病毒侵染性克隆的构建。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的是提供一种葫芦轻花叶病毒。
[0007]本专利技术的第二目的是提供一种侵染性克隆载体及其构建方法和应用。
[0008]本专利技术在获得侵染瓜蒌的葫芦轻花叶病毒RNA1和RNA2全基因组序列基础上，在外源序列引入、基因重组、菌株培养、质粒转化等方面进行了优化，基于含有35S启动子的植物双元表达载体pCB301，分别构建了葫芦轻花叶病毒RNA1和RNA2全长cDNA序列的侵染性克隆，通过农杆菌介导转化后在寄主体内转录、复制、侵染，以用于病毒的功能基因组研究。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：
[0010]一种葫芦轻花叶病毒(Cucurbit mild mosaic virus，CuMMV)，其RNA1和RNA2全基因组序列如SEQ ID No：21
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22所示。
[0011]本专利技术所述的葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆载体，分别由葫芦轻花叶病毒CuMMV的RNA1和RNA2的全基因组序列融合到带35S启动子和核酶Rz的载体pCB301制备得到。
[0012]进一步的，由葫芦轻花叶病毒CuMMV的RNA1和RNA2全基因组序列添加ployA尾后融合到带35S启动子和核酶Rz的载体pCB301制备得到。
[0013]该葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆载体的制备方法，包括以下的步骤：
[0014](1)获得葫芦轻花叶病毒CuMMV的RNA1和RNA2核苷酸全序列﹔
[0015](2)将CuMMV的RNA1分为3段，RNA2分为2段，分别设计同源重组引物CuMMV
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RNA1
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insert1F/1R，CuMMV
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RNA1
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insert2F/2R，CuMMV
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RNA1
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insert3F/3R，以及CuMMV
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RNA2
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insert1F/1R，CuMMV
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RNA2
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insert2F/2R，以瓜蒌病叶RNA反转录的cDNA为模板进行片段扩增，获得RNA1的三个片段：CuMMV
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RNA1
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insert1、CuMMV
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RNA1
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insert2和CuMMV
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RNA1
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insert3以及RNA2的两个片段CuMMV
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RNA2
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insert1和CuMMV
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RNA2
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insert2。
[0016]所述引物CuMMV
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RNA1
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insert1F/1R，CuMMV
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RNA1
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insert2F/2R，CuMMV
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RNA1
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insert3F/3R，CuMMV
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RNA2
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insert1F/1R和CuMMV
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RNA2
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insert2F/2R的基因序列分别如SEQ ID No：1
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10所示；
[0017](3)选用StuI和SmaI双酶切pCB301载体，产物与步骤(2)获得的扩增片段进行切胶回收纯化，纯化产物进行同源重组反应，连接产物转化进大肠杆菌后，筛选目的片段插入为阳性的单克隆，进一步测序验证从而获得具有CuMMV RNA1和RNA2基因组核苷酸全序列的克隆pCB301
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CuMMV
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RNA1和pCB301
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CuMMV
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RNA2；
[0018](4)提取含pCB301
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CuMMV
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RNA1和pCB301
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CuMMV
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RNA2的质粒，获得葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆载体。
[0019]其中，所述步骤(1)具体包括：
[0020]1.1)将产生花叶、斑驳、褪绿等疑似受病毒侵染的瓜蒌植物病叶总RNA的提取，将样品进行小RNA测序；
[0021]1.2)CuMMV核苷酸全序列的扩增：根据小RNA测序结果组装的Contigs，结合病毒数据库中其它CuMMV的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种葫芦轻花叶病毒(Cucurbit mild mosaic virus，CuMMV)，其特征在于：其RNA1和RNA2全基因组序列如SEQ ID No：21
‑
22所示。2.权利要求1所述的葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆载体，其特征在于：分别由葫芦轻花叶病毒RNA1和RNA2的全基因组序列融合到带35S启动子和核酶Rz的载体pCB301制备得到。3.权利要求2所述侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于：包括以下的步骤：(1)将葫芦轻花叶病毒CuMMV的RNA1分为3段，RNA2分为2段，分别设计同源重组引物CuMMV
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RNA1
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insert1F/1R，CuMMV
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RNA1
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insert2F/2R，CuMMV
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RNA1
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insert3F/3R，以及CuMMV
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RNA2
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insert1F/1R，CuMMV
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RNA2
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insert2F/2R，以瓜蒌病叶RNA反转录的cDNA为模板进行片段扩增，获得RNA1的三个片段：CuMMV
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RNA1
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insert1、CuMMV
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RNA1
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insert2和CuMMV
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RNA1
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insert3；以及RNA2的两个片段CuMMV
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RNA2
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insert1和CuMMV
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RNA2
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insert2；所述引物CuMMV
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RNA1
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insert1F/1R、CuMMV
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RNA1
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insert2F/2R、CuMMV
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RNA1
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insert3F/3R、CuMMV
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RNA2
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insert1F/1R和CuMMV
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RNA2
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insert2F/2R的基因序列分别如SEQ ID No：1
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10所示；(2)选用StuI和SmaI双酶切pCB301载体，产物与步骤(1)获得的扩增片段进行切胶回收纯化，纯化产物进行同源重组反应，连接产物转化进大肠杆菌后，筛选目的片段插入为阳性的单克隆，进一步测序验证从而获得具有CuMMV RNA1和RNA2基因组核苷酸全序列的克隆pCB301
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CuMMV
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RNA1和pCB301
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CuMMV
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RNA2；(3)培养含pCB301
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CuMMV
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RNA1和pCB301
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CuMMV
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RNA2质粒的大肠杆菌，提取质粒，获得葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆载体。4.根据权利要求3所述的侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)具体包括：针对葫...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀玲，周雪平，陈诚，杜敏，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：