苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种微生物工程菌技术领域。苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌，为菌株Bt59肽聚糖水解酶基因hyd1和转录调控因子基因sigK双突变工程菌Bt59(Δhyd1

【技术实现步骤摘要】
苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种微生物工程菌
，特别涉及一种苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌、上述工程菌的构建方法、以及上述工程菌的应用。

技术介绍

[0002]苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）是一类广泛存在于土壤中的革兰氏阳性菌，在芽胞形成的同时能够合成具有特异杀虫活性的杀虫晶体蛋白，在农、林及卫生害虫的防治中得到了广泛的应用。Bt以色列亚种（B. thuringiensissubsp.israelensis, Bti）是第一个被证明对双翅目幼虫具有毒性的Bt亚种，可以产生Cry4Aa、Cry4Ba、Cry11Aa和Cyt1Aa等多种杀虫晶体蛋白，对500多种蚊、蜹和蝇具有毒力活性。晶体蛋白在芽胞形成II期产生，有三种不同类型晶体组成，位于芽胞外膜外，在生长过程中随着芽胞的释放而脱落。晶体蛋白被幼虫取食后在昆虫中肠碱性蛋白酶作用下解离出毒性肽，破坏肠道正常功能，造成昆虫幼虫死亡。得益于其广谱、高效的杀蚊活性，对环境及非靶标生物安全，以及其显著的经济效益、社会效益和生态效益，Bti被成功并广泛地应用于病媒蚊虫的生物防治。
[0003]晶体蛋白在芽胞形成后期通过母细胞裂解释放出来，由于没有细胞壁包埋，裸露在环境中的晶体蛋白易受到太阳辐射、温度等自然界因素的影响而失活，从而使Bti的杀虫持效性显著下降，其中紫外线（UV）辐射被认为是最关键的影响因素。为了克服环境不利因素对晶体蛋白的影响，传统的途径主要是通过添加UV保护剂或者采用物理材料包埋晶体蛋白以提高Bt蛋白对UV的耐受性，增强毒素蛋白的持效稳定性。在母细胞不裂解菌株Bt 407
‑
中表达Cry1C/Ab嵌合晶体蛋白，利用不裂解的细胞壁保护晶体蛋白免受UV破坏而失活，增加了菌株杀虫活性的持效期。在Bt库斯塔克亚种（B. thuringiensissubsp.kurstaki, Btk）HD73菌株中，通过敲除关键肽聚糖水解酶基因cwlC构建了母细胞不裂解菌株，并保持了菌株原始毒力。因此，通过敲除关键肽聚糖水解酶基因，阻断母细胞裂解，利用细胞壁包埋杀虫晶体蛋白，不仅保持了菌株的杀虫活性，而且显著增强了蛋白的持效稳定性。
[0004]Bti菌株Bt59参与母细胞裂解的的肽聚糖水解酶有CwlB、CwlC。和HD73中功能不同，敲除cwlC只能延迟而不能完全阻断Bt59母细胞裂解。在Bti芽胞生长后期，cwlC和cwlB均受转录调控因子SigK调控，敲除sigK后可以完全抑制cwlB和cwlC的表达，但仍然不能完全阻断Bti母细胞裂解。
[0005]申请人对于上述技术问题进行了深入研究，敲除sigK后可以完全抑制cwlB和cwlC的表达，但仍然不能完全阻断Bti母细胞裂解的原因：Bti菌株Bt59参与母细胞裂解的的肽聚糖水解酶，除了CwlB、CwlC外，还有Hydrolase1 (Hyd1)，而且 Hyd1是在Bti中特异性表达的。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术的第一个目的是提供一种苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌，用以解决苏云金杆菌以色列亚种工程菌持效期短的技术问题。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案，苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌，其特征是，所述工程菌为菌株Bt59肽聚糖水解酶基因hyd1和转录调控因子基因sigK双突变工程菌Bt59(Δhyd1
‑
sigK)，保藏编号：CGMCC No.27191，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2023年4月23日；分类命名：Bacillus thuringiensis var. israelesis。
[0008]本专利技术通过生物信息学和体外活性分析，鉴定了一个在苏云金杆菌以色列亚种中特异性表达的水解酶基因hyd1，重组水解酶Hyd1具有水解Bti细胞壁的活性，并在Bti母细胞裂解中起着关键作用。Bti的杀虫晶体蛋白受环境中的紫外线等因素的影响易失活，严重影响Bti的实际使用效果，而细胞壁可以保护晶体蛋白免受外界环境的影响，增强其持效性。
[0009]申请人发现，Bti菌株Bt59参与母细胞裂解的的肽聚糖水解酶除了有CwlB、CwlC外，还有Hydrolase1 (Hyd1)，且 Hyd1是在Bti中特异性表达的。和HD73中功能不同，敲除cwlC只能延迟而不能完全阻断Bt59母细胞裂解。在Bti芽胞生长后期，cwlC和cwlB均受转录调控因子SigK调控，敲除sigK后可以完全抑制cwlB和cwlC的表达，但不能完全阻断Bti母细胞裂解。hyd1受转录调控因子SigE调控，sigK的缺失并不影响hyd1的表达。因此，同时敲除肽聚糖水解酶基因hyd1和转录调控因子sigK可以构建母细胞不裂解Bti菌株，延长其持效期。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌的构建方法，用以解决现有苏云金杆菌以色列亚种生产菌株持效期短的技术问题。
[0011]为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌的构建方法，以Bt59基因组为模板，利用重叠PCR技术，分别获得细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段和转录调控因子基因sigK缺失的基因片段，然后利用同源重组技术，将获得的细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段和转录调控因子基因sigK缺失的基因片段，构建到基因操作载体pMAD中，经电击转化至Bti感受态细胞中，高温筛选后，即可获得双突变工程菌Bt59(Δhyd1
‑
sigK)。
[0012]本专利技术利用基因敲除技术，可以快速对Bti进行基因改造，以获得优良性状的工程菌，同时高温可以使外源质粒丢失，工程菌不含外源基因、无标记抗性，可直接用于工业化生产发酵。
[0013]本专利技术利用同源重组技术，成功构建了肽聚糖水解酶基因hyd1缺失突变体、转录调控因子基因sigK缺失突变体、hyd1和sigK双缺失突变体。hyd1和sigK双突变可以完全阻断Bti母细胞裂解，可以利用细胞壁包埋晶体蛋白，以增强其环境稳定性。本专利技术构建的双突变工程菌，不产芽胞，具有较高的杀虫活性以及较强的紫外线抗逆性。
[0014]为解决转录调控因子基因sigK缺失的基因片段如何获得的技术问题，所述利用重叠PCR技术，获得转录调控因子基因sigK缺失的基因片段，包括：以Bt59基因组为模板，利用重叠引物一SEQ ID NO.9
‑
10经重叠PCR，获得转录调控因子基因sigK缺失的基因片段，将转录调控因子基因sigK缺失的基因片段连接到线性化的pMAD质粒上，得到重组质粒；重组质粒去甲基化后，经电击转化至Bt59细胞中，获取sigK缺失突变株Bt59(ΔsigK)；
所述重叠PCR引物一SEQ ID NO.9为：上游引物ATCGATGCATGC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌，其特征是，所述工程菌为菌株Bt59肽聚糖水解酶基因hyd1和转录调控因子基因sigK双突变工程菌Bt59(Δhyd1
‑
sigK)，保藏编号：CGMCC No.27191。2.权利要求1所述的苏云金杆菌以色列亚种双突变工程菌的构建方法，其特征是，以Bt59基因组为模板，利用重叠PCR技术，分别获得细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段和转录调控因子基因sigK缺失的基因片段，然后利用同源重组技术，将获得的细胞壁水解酶基因hyd1缺失的基因片段和转录调控因子基因sigK缺失的基因片段，构建到基因操作载体pMAD中，经电击转化至Bti感受态细胞中，高温筛选后，即可获得双突变工程菌Bt59(Δhyd1
‑
sigK)。3.根据权利要求2所述构建方法，其特征是，所述利用重叠PCR技术，获得转录调控因子基因sigK缺失的基因片段，包括：以Bt59基因组为模板，利用重叠引物一SEQ ID NO.9
‑
10经重叠PCR，获得转录调控因子基因sigK缺失的基因片段，将转录调控因子基因sigK缺失的基因片段连接到线性化的pMAD质粒上，得到重组质粒；重组质粒去甲基化后，经电击转化至Bt59细胞中，获取sigK缺失突变株Bt59(ΔsigK)；所述重叠PCR引物一SEQ ID NO.9
‑
10为：上游引物ATCGATGCATGCCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄立鑫，徐健，韩光杰，李传明，刘琴，陆玉荣，夏杨，张楠，
申请(专利权)人：江苏里下河地区农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：