用于组成型表达的新型启动子变体及其用途制造技术

本发明专利技术提供一种新型启动子变体，其中缺失了大肠杆菌(Escherichia coli)gapA(3

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于组成型表达的新型启动子变体及其用途


[0001]本专利技术涉及一种新型启动子变体等，更详细地，涉及一种能够组成型地高表达靶蛋白的新型启动子变体及其各种用途。

技术介绍

[0002]随着分子生物学的发展，已经查明了几种调节基因表达的机制。基因表达是指细胞内发生的根据通过转录(transcription)及翻译(translation)输入到基因的代码合成蛋白质的一系列过程。尤其，转录过程是基因表达的初始阶段，RNA聚合酶在各种辅助因子的帮助下与位于基因上位的启动子(promoter)序列结合而启动，转录因子(TF，transcription factor)是此类辅助因子之一，已知其可以直接与启动子序列结合。尤其，由于原核生物中基因表达的调节主要发生在转录阶段，因此研究人员不断发现新的转录因子及启动子。
[0003]为了在工业上生产酶等外源蛋白，主要将通过用含有外源蛋白基因的pET型表达载体转化大肠杆菌等原核生物而制备的转化体用作表达系统。用pET型表达载体转化的原核生物表达系统通常需要IPTG(异丙基
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β
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D
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硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl
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β
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D
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thiogalactopyranoside))等昂贵的表达衍生物(inducer)，而且存在需要细致地调节衍生物浓度或设备、表达诱导时间等的缺点。
[0004]另一方面，为了大量生产具有将果糖转化为阿卢糖(或阿洛酮糖)的活性的阿洛酮糖差向异构酶(或阿卢糖差向异构酶)，提出了使用作为GRAS(公认安全(Generally Recognized As Safe))菌株的棒状杆菌属菌株作为宿主细胞的表达系统。关于基于棒状杆菌属菌株的阿洛酮糖差向异构酶(或阿卢糖差向异构酶)表达系统，韩国授权专利第10
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1656063号公开了编码阿洛酮糖差向异构酶的核苷酸序列以及可操作地连接到其上游(upstream)，并含有调节阿洛酮糖差向异构酶在棒状杆菌属菌株中表达的调节序列的基因表达盒，上述调节序列由转录启动子、第一核糖体结合区(ribosome binding region，RBS)序列、第一空间序列、接头序列以及第二RBS序列等组成。并且，韩国授权专利第10
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1695830号公开了编码阿洛酮糖差向异构酶的核酸序列、可操作地连接到其上游(upstream)并含有调节上述阿洛酮糖差向异构酶在棒状杆菌属菌株中表达的调节序列的基因表达盒，上述调节序列包括大肠杆菌(E.coli)衍生的转录启动子(transcription promoter)。然而，基于棒状杆菌的阿洛酮糖差向异构酶(或阿卢糖差向异构酶)表达系统由于可使用的启动子表达水平低且选择范围小，因而不适合大量的酶表达系统。
[0005]因此，为了阿洛酮糖差向异构酶(或阿卢糖差向异构酶)的大量生产或由利用阿洛酮糖差向异构酶(或阿卢糖差向异构酶)的果糖阿卢糖的大量生产，需要开发组成型表达启动子以及包含其的组成型表达系统，该组成型表达启动子能够在大肠杆菌宿主细胞的一般培养条件下稳定且高水平地表达外源蛋白而不抑制生长。

技术实现思路

[0006]技术问题
[0007]本专利技术是在传统技术背景下导出的，本专利技术的目的在于提供能够组成型地高表达靶蛋白的新型启动子变体。并且，本专利技术的目的在于提供上述新型启动子变体的各种用途。
[0008]解决问题的手段
[0009]本专利技术的专利技术人通过将作为用于表达大肠杆菌(Escherichia coli)gapA(3
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磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde
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phosphate dehydrogenase))基因的启动子的gapA基因启动子与编码阿卢糖差向异构酶的多核苷酸可操作地连接来制备重组表达载体，并将其引入大肠杆菌后进行转化。在此情况下，由于gapA启动子或阿卢糖差向异构酶基因序列发生随机变异，因此本专利技术的专利技术人获得了用与引入的重组表达载体不同的各种重组表达载体转化的重组大肠杆菌。在通过上述随机变异获得的重组表达载体中，对用阿卢糖差向异构酶基因序列未发生变异而只有gapA基因启动子发生变异的重组表达载体转化的重组大肠杆菌的阿卢糖差向异构酶表达活性进行了比较，结果确认缺失gapA基因启动子的碱基序列中第130个核苷酸的腺嘌呤(A)的启动子变体能够组成型地高表达阿卢糖差向异构酶，从而完成了本专利技术。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术的一例提供一种由序列号9的碱基序列组成的启动子变体。并且，本专利技术的一例提供一种包含由序列号9的碱基序列组成的启动子变体的重组载体。并且，本专利技术的一例提供一种表达载体，其包含编码靶蛋白的多核苷酸以及可操作地与其连接并由序列号9的碱基序列组成的启动子变体。并且，本专利技术的一例提供一种用上述表达载体转化的重组菌株。并且，本专利技术的一例提供一种使用上述重组菌株生产靶蛋白的方法。并且，本专利技术的优选一例提供一种由底物制备酶转化反应产物的方法，其包括在含底物溶液中加入上述重组菌株并进行酶转化反应的步骤。
[0011]专利技术的效果
[0012]本专利技术的新型启动子变体可以在大肠杆菌中组成型地高表达靶蛋白，特别是酶。因此，通过使用用包含本专利技术的新型启动子变体的表达载体转化的重组菌株，可以经济地大量生产靶蛋白，特别是酶。作为一例，通过使用用包含本专利技术的新型启动子变体的表达载体转化的重组菌株，可以经济地大量生产阿卢糖差向异构酶或者可以从果糖经济地大量生产阿卢糖。
附图说明
[0013]图1为本专利技术实施例中制备的重组表达载体pPgapAm1
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FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]的酶切图谱。
[0014]图2为本专利技术实施例中制备的重组表达载体pPgapAm2
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FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]的酶切图谱。
[0015]图3为本专利技术实施例中制备的重组表达载体pPblma
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FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]的酶切图谱。
[0016]图4为示出当使用本专利技术实施例中制备的重组大肠杆菌进行果糖到阿卢糖的转化反应时根据反应时间的转化率。
具体实施方式
[0017]以下，将具体说明本专利技术。
[0018]本专利技术中使用的术语“启动子”是指与待转录的靶核苷酸序列可操作地连接并调节上述靶核苷酸序列的转录的最小核酸序列。并且，上述启动子可包含足以允许表达细胞类型特异性或外部信号或制剂诱导的可调节启动子依赖基因的启动子元件，这些元件可以位于基因的5'或3'部分。上述启动子包括保守型启动子以及诱导型启动子这两者。启动子序列可以源自原核生物、真核生物或病毒。原核生物中的启动子通常被定义为与RNA聚合酶结合的转录起始点(Transcription Start Site)紧邻的结合位点。
[0019]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种启动子变体，其特征在于，由序列号9的碱基序列组成。2.一种重组载体，其特征在于，包含根据权利要求1所述的启动子变体。3.一种表达载体，其特征在于，包含编码靶蛋白的多核苷酸以及与其可操作地连接的根据权利要求1所述的启动子变体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，上述靶蛋白为酶。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，上述酶为阿卢糖差向异构酶。6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，上述阿卢糖差向异构酶由序列号3的氨基酸序列、序列号5的氨基酸序列或序列号...

【专利技术属性】
技术研发人员：李芝河，崔银硕，金柏中，金泰均，郑大翰，曹承佑，金学俊，
申请(专利权)人：大象株式会社，
类型：发明
国别省市：